Transformierender Wachstumsfaktor TGF-β

Transformierende Polypeptidwachstumsfaktoren

Die transformierenden Wachstumsfaktoren bilden eine Familie von über 40 strukturell ähnlichen Polypeptiden. Sie umfasst zahlreiche Unterfamilien, darunter TGF-ß, Activin und BMP (Bone Morphogenetic Protein), die eine hohe Sequenzhomologie aufweisen und in nahezu allen zoologischen Spezies vorkommen. Tabelle 1 zeigt repräsentative Mitglieder dieser Familie und die faszinierende Vielfalt physiologischer Funktionen, an deren Regulierung sie beteiligt sind.

TGF-ß-Rezeptoren

Sämtliche Effekte dieser Wachstumsfaktoren werden über spezifische membranständige Glykoproteinrezeptoren vermittelt, die man aufgrund unterschiedlicher struktureller und funktioneller Eigenschaften in zwei Subfamilien (Typ 1 und 2) einteilt. Beide verfügen über Serin/Threonin-Kinase-Aktivität. Bisherige Rezeptorcharakterisierungen ergaben unterschiedliche Proteinstrukturen, anhand derer man sie in fünf Typ-2- und sieben Typ-1-Rezeptoren unterteilt.

Exemplarisch soll hier das Wechselspiel der Typ-1- und Typ-2-Rezeptoren nach Bindung von TGF-ß beschrieben werden. Es kommt nur zu einer Auslösung von Folgeprozessen, wie sie in Abbildung 1 zusammengestellt sind, wenn beide Rezeptoren sich durch die Überbrückung mit TGF-ß zu einem Komplex zusammenlagern.

Bindung von TGF-ß an die Rezeptoren

Das in seiner bioaktiven Form als Dimer vorliegende TGF-ß bindet zunächst an den Typ-2-Rezeptor und erst danach zusätzlich an den Typ-1-Rezeptor. Dies bezeichnet man als sequenziellen Bindungsmodus [2]. Zwei TGF-ß Accessory Proteins, das Endoglin in den Endothelien und das Betaglykan, unterstützen den Zutritt des TGF-ß an den Typ-2-Rezeptor [3].

Im Rezeptorkomplex, der durch die Bindung von TGF-ß an beide Rezeptoren zustande kommt, erfolgt eine Autophosphorylierung des Typ-2-Rezeptors an Serin- und Threoninresten und damit die Aktivierung einer Kinasefunktion. Das durch TGF-ß "angeschaltete" rezeptoreigene Enzym phosphoryliert nun die GS-Domäne des Typ-1-Rezeptors, und zwar wiederum an Serin- und Threoninresten. Die GS-Domäne ist ein Aktivierungszentrum für die direkt benachbarte Kinasestruktur des Typ-1-Rezeptors.

Smad-Proteine

Nach der Zusammenlagerung der Rezeptoren und Phosphorylierung der GS-Domäne können sich bestimmte Smad-Proteine, die im Ruhezustand als inaktive globuläre Homooligomere im Zytoplasma vorliegen [10], an den Typ-1-Rezeptor anlagern und werden durch ihn phosphoryliert. Diese und verschiedene andere Smad-Proteine sind es, die TGF-ß-vermittelte Signale letztlich bis in den Zellkern an ihr Ziel, die TGF-ß-Gene, übertragen [10].

Der Name der Smad-Proteine leitet sich von den für sie kodierenden Genen ab, die in genetischen Studien an Drosophila und C. elegans erstmals identifiziert wurden. Das Drosophila-Gen wird als Mad (Mother against decapentaplegic), das in C. elegans vorliegende als Sma (Small body size) bezeichnet; die Kombination von Sma und Mad ergab den Namen Smad [3]. Strukturell und funktionell unterscheidet man drei Unterfamilien der Smad-Proteine, denen eine ähnliche, stark konservierte Grundsequenz zu eigen ist (Abb. 2):

• Rezeptor-regulierte Smad-Proteine (R-Smads),
• Kooperative Smad-Proteine (Co-Smads) und
• Inhibitorische Smad-Proteine (I-Smads).

R-Smads und Co-Smads

Innerhalb der ersten Unterfamilie interagieren

• Smad-2 und Smad-3 mit den TGF-ß-Typ-1-Rezeptoren [10],
• Smad-1 und Smad-8 mit den Rezeptoren des Bone Morphogenetic Protein (BMP) und
• Smad-5, das strukturell Smad-1 und Smad-8 nahe steht, mit beiden Rezeptoren.

Erst nach Phosphorylierung können die R-Smads an die zytoplasmatischen Co-Smads binden und somit die Smad-Komplexe bilden, die sich an DNA-Promotoren im Zellkern anlagern und letztendlich die Transkription auslösen [6]. Bislang wurde als einziges Co-Smad in humanen Zellen Smad-4 nachgewiesen, das mit allen aktivierten R-Smads wechselwirkt [10].

I-Smads

Die I-Smads zeichnen sich durch markante Strukturvariationen im Vergleich zu R-Smads und Co-Smads aus, auf die zurückzuführen ist, dass sie die TGF-ß-vermittelte Signaltransduktion antagonisieren [3]. Smad-6 senkt besonders die BMP-Effekte, während Smad-7 TGF-ß und BMP etwa gleich stark inhibiert [6].

Beide I-Smads werden bei großem Angebot an Wachstumsfaktoren vermehrt gebildet (negative Rückkopplung) und können sowohl mit den R-Smads um die Rezeptorbindung konkurrieren als auch die Wechselwirkung von R-Smads und Co-Smads verhindern [8]. In beiderlei Hinsicht stellen sie kompetitive Antagonisten dar. Für Smad-6 ist außerdem nachgewiesen worden, dass es sich an Stelle der Smad-Komplexe an TGF-ß-assoziierte Transkriptionsfaktoren anlagert, die somit keine DNA-Bindung mehr eingehen können [8].

Während R-Smads und Co-Smads sich im nicht-komplexierten Zustand immer im Zytoplasma befinden, halten sich die I-Smads bei Abwesenheit von TGF-ß überwiegend im Zellkern auf. Auf den Reiz von TGF-ß hin werden sie auf noch ungeklärte Weise aus dem Zellkern ausgeschleust, können also die R-Smads im Zytosol erst verzögert antagonisieren [3].

Ungewöhnlich ist, dass einige Effekte von TGF-ß, wie etwa die Apoptose-Induktion in Prostatakarzinomzellen, durch I-Smads vermittelt werden [3]. Wie die normalerweise inhibitorischen Proteine diese spezifische Wirkung ausüben, ist bislang nicht geklärt.

Aufbau der Smad-Proteine

Alle Smad-Proteine sind einander im Aufbau relativ ähnlich. Sie bestehen aus drei Teilen: zwei hochkonservierten Domänen an den Kettenenden und einem Verbindungsstück (Linker) variabler Länge und Sequenz in der Mitte (Abb. 3).

• Am N-Terminus befindet sich die MH1-Domäne, die an bestimmte DNA-Abschnitte (Promotoren) bindet.
• Die C-terminale MH2-Domäne kann an diverse Proteine binden, so - an Typ-1-Rezeptoren, - an das Smad Anchor for Receptor Activation Protein (SARA), einen spezifischen Smad-Rezeptor, der den Smad-Transport sowie dessen Fixierung an den TGF-ß-Typ-1-Rezeptor induziert [5], - an andere Smad-Proteine und - andere Transkriptionsfaktoren des Zellkerns.

Nur R-Smads weisen am äußersten C-terminalen Ende das SSV/MS-Motiv auf. Das SSV/MS-Motiv ist nach seinen beiden möglichen Aminosäurensequenzen benannt (Serin-Serin-Valin-Serin bzw. Serin-Serin-Methionin-Serin; vereinfacht auch: SSxS). Damit R-Smads an Smad-4 binden können, muss das SSV/MS-Motiv phosphoryliert werden [6]. Erst dieser Vorgang legt nämlich die MHZ-Domäne für die Bindung an Smad-4 frei. Die erfolgte Phosphorylierung bleibt bestehen, wenn sich das R-Smad vom Rezeptorkomplex ablöst und mit dem Co-Smad zusammenlagert.

Interaktionen des Smad-Komplexes mit Transkriptionsfaktoren oder DNA

Der dimere Smad-Komplex permeiert in den Zellkern, wo er Wechselwirkungen mit Transkriptionsfaktoren eingeht oder direkt mit der DNA interagiert [4]. Dadurch induziert er die Expression bestimmter Gene, wie z. B. I-Smad-Gene [3] oder die Gene p15 und p21; beide kodieren Cyclin-abhängige Kinaseinhibitoren, die den Zellteilungszyklus stoppen und damit die Proliferationsrate senken [6]. Aber der Smad-Komplex scheint auch die Expression bestimmter Gene zu hemmen, z. B. das Gen c-myc, das Wachstumsfaktoren kodiert [6].

Für den Zusammenschluss des Smad-Komplexes mit Transkriptionsfaktoren sei der Activin Responsive Factor (ARF) angeführt [3]. Der ARF bindet an die MH2-Domäne von Smad-2; nur dadurch tritt die notwendige Konformationsänderung ein, die es ihm ermöglicht, mit dem Activin Responsive Element (ARE) am Mix2-Gen zu interagieren [4]. Das Co-Smad bleibt während des ganzen Vorgangs an Smad-2 gebunden, hat aber keinen direkten Einfluss auf den Transkriptionsfaktor.

Die Smad-Komplexe im Zellkern werden durch selektive Proteolyse im Zuge des Ubiquitin-Proteasom-Signalweges abgebaut: Aktiviertes Ubiquitin bindet an seine verschiedenen Substrate, worauf das Enzym Proteasom diese ubiquitinierten Proteine erkennt und lysiert.

Experimente an Knock-out-Mäusen

Die Funktion der Smad-Proteine und von TGF-ß ist in den letzten Jahren durch Experimente an Knock-out-Mäusen erforscht worden. Es sind transgene Mäuse, bei denen einzelne Gene, die für bestimmte Proteine kodieren, gezielt ausgeschaltet wurden. Die Ausschaltung erfolgt durch Transfer von Fremd-DNA in Embryonalzellen. Die Fremd-DNA enthält ein dem auszuschaltenden Gen exakt entsprechendes Segment, das aber nicht abgelesen werden kann und daher funktionslos ist.

Verschiedene Arbeitsgruppen haben die Gene, die Smad-2, Smad-3, Smad-4 und Smad-5 sowie TGF-ß kodieren, ausgeschaltet. (Untersuchungen zu den I-Smads folgen wahrscheinlich in Kürze.) Nur die Smad-3-Knock-out-Maus überlebt die Embryogenese. Ein Ausschalten der anderen Smad-Gene beendete das Leben der Tiere in frühen Embryonalstadien [9] und verdeutlicht die Notwendigkeit der Smad-Proteine.

Smad-2- und Smad-4-Knock-outs

Wenn Smad-2 oder Smad-4 fehlt, verlaufen die allerersten Lebensprozesse, nämlich die Furchung der Zygote, ihre Entwicklung zur Morula und zur Blastozyste und deren Einnistung in die Uteruswand, ohne Störung, sieht man von einem häufig eintretenden und oft tödlichen Phänomen ab: Ohne diese Smads ist die TGF-ß-gesteuerte Adhäsion der Embryonalzellen an die Uteruswand stark herabgesetzt.

Nach einer erfolgreichen Einnistung folgt normalerweise die Perigastrulation, also die Ausbildung der drei Keimblätter, aus denen sämtliche Körperorgane entstehen [9]. Ohne Smad-2 oder Smad-4 ist dieser Prozess jedoch erheblich gestört:

• Das Ektoderm, das die äußere Hülle des Embryos mit der Haut, den Nerven und Sinnesorganen bildet, entsteht gar nicht oder nur sehr unvollständig (ein markantes Indiz sind die oftmals fehlenden Augen).
• Das die Eingeweide bildende und den Dottersack umhüllende Endoderm ist in den meisten Fällen annähernd normal strukturiert.
• Das Mesoderm fehlt völlig, weil Ektoderm und Endoderm kaum auseinander weichen und die Mesoderm-Gene nicht exprimiert werden. Spätestens zu diesem Zeitpunkt, etwa am vierten Tag der Embryonalperiode, tritt bei allen Mäusen der Tod ein.

Die Defekte sind bei den Smad-4-Knock-outs deutlich stärker ausgeprägt als bei den Smad-2-Knock-outs. Dies lässt vermuten, dass auch dem BMP (das ohne Smad-4 funktionsunfähig ist) für die Embryogenese eine große Bedeutung zukommt. Durch den frühen Tod der Smad-4-Knock-out-Embryonen kann die Vermittlung weiterer physiologischer Ereignisse durch Smad-4 nicht überprüft werden.

TGF-ß-Knock-outs und Smad-5-Knock-outs

Mäuseembryonen, denen TGF-ß, der TGF-ß-Typ-2-Rezeptor oder Smad-5 fehlt, haben eine weitgehend normale Gastrulation (Kompensationsmechanismen mit BMP könnten hier eine Rolle spielen), leiden aber an einer schweren Störung der Angiogenese mit letalem Ausgang am 10. Embryonaltag [11].

Das kardiovaskuläre System entwickelt sich als eins der ersten embryonalen Organe und verläuft über eine Kondensation von Mesodermzellen im Dottersack zu Blutinseln. Die Mesodermzellen wandeln sich hierbei in Hämangioblasten, die später zu Endothel- und Blutzellen ausdifferenzieren. Die Blutinseln formen ein Gefäßnetz, das nach und nach den ganzen Embryo geordnet durchwächst, wobei sich neue Leitungen aus bestehenden und zartere aus derberen bilden. Am Tag 9,5 ist ein gut ausgebildetes, mit zahlreichen Blutzellen gefülltes Gefäßsystem sichtbar. Neben TGF-ß bedarf die Angiogenese noch weiterer Faktoren wie Angiopectin, Fibroblast Growth Factor (FGF) und Platelet-Derived Growth Factor (PDGF).

Fehlen TGF-ß oder Smad-5, kommt es zwar noch zur Umwandlung der Mesodermzellen in Hämangioblasten, aber nicht zur geordneten Vaskularisierung. Der Dottersack bleibt fast gänzlich frei von Blutgefäßen, der Embryo kann also nur vereinzelt Gefäßstränge weiterführen. Auch die an manchen anderen Stellen einsetzende Gefäßbildung bleibt rudimentär. Die wenigen diffus verlaufenden Adern weisen ein viel zu großes Lumen und stark verdünnte, kaum an das umliegende Mesenchym angelagerte Endothelien auf. Das Zusammenwachsen der Endothelzellen bleibt nämlich aus, ebenso die Bildung der Gefäßmuskulatur. Die Stabilität der Gefäßwand selbst und der Haut im Gewebe sind dadurch vermindert. Blutzellen sammeln sich als Aggregate in den Gefäßen, aber auch frei im Gewebe, weil die Gefäße durchlässig sind. Überdies ist die Apoptoserate des Mesenchyms stark erhöht, sodass bereits gebildete Blutgefäße wieder absterben. Abbildung 4 veranschaulicht die Blutgefäßdefekte der Smad-5-Knock-outs.

Smad-3-Knock-outs

Mäuse, denen Smad-3 fehlt, überstehen die gesamte intrauterine Phase, aber kurz nach der Geburt zeigen sie

• eine starke Abszess- und Fistelbildung in der Mukosa, was auf eine Immunschwäche hinweist, und
• eine beschleunigten Proliferation von Keratinozyten, die sich in Schuppen von der Haut lösen.

An diesen beiden Geweben kann TGF-ß seine antiproliferativen Effekte nicht mehr entfalten [1]. (Diese Beobachtungen legen übrigens eine Dysregulation der TGF-ß-Signalkaskade als Teilmechanismus von hyperproliferativen Hauterkrankungen nahe; s. u.)

Die Jungmäuse erliegen spätestens drei Wochen nach der Geburt ihrer Immunschwäche und den resultierenden Darmerkrankungen. Die verursachenden Bakterien in der Darmflora sind ausnahmslos gramnegativ und für den normalen Organismus harmlos, sie liegen allerdings in erhöhter Zahl vor [12]. Trotz der schwachen Immunantwort mit wenig Zellteilungen und unzureichender Infiltration von erkrankten Geweben weisen Smad-3-Knock-out-Mäuse nach Verletzungen eine deutlich verkürzte Wundheilungszeit auf (knapp 2 Tage statt 4 bis 5 Tage) [1]. Das scheinbar paradoxe Phänomen lässt sich erklären:

Der Wundheilungsvorgang ist gekennzeichnet durch die Ausschüttung von TGF-ß im femtomolaren Bereich aus degranulierenden Thrombozyten, die in das Wundareal einwandern. TGF-ß bewirkt, dass auch Monozyten und Neutrophile in das Wundareal einwandern. Diese eliminieren Mikroorganismen und halten die Wundränder sauber, fördern allerdings auch durch Zytokin- und Proteasefreisetzung lokale Entzündungen, die der Wundheilung nicht dienlich sind. Von TGF-ß ebenfalls stimulierte Fibroblasten vollziehen eine Chemotaxis, proliferieren stark, lassen den Wundrand kontrahieren und sezernieren Matrixmaterial für die Gewebebildung wie Kollagen und Fibronectin. Man geht davon aus, dass die Gene, die Kollagen und Fibronectin kodieren, durch Smad-Proteine aktiviert werden.

Die in den Wundbereich eingewanderten Leukozyten und Fibroblasten sezernieren erneut TGF-ß, sodass dessen Gewebespiegel zunehmend steigt und die Einwanderung der Zellen verstärkt, bis eine kompensatorische Down-Regulation von Smad-3 eintritt. Darauf sinkt die beschriebene Aktivität der Zellen wieder; es wird aber auch die Proliferationshemmung der Keratinozyten durch TGF-ß aufgehoben, sodass die Re-Epithelisierung der Wunde stattfindet.

Die beschleunigte Wundheilung ohne TGF-ß, wie sie bei Smad-3-Knock-out-Mäusen beobachtet wird, kommt wahrscheinlich

• durch die verstärkte Keratinozytenproliferation und
• durch die reduzierte Einwanderung von Leukozyten

zustande. Diese beiden Faktoren scheinen die verminderte Bildung von Matrixmaterial mehr als zu kompensieren.

Doch die Bewertung der beschleunigten Wundheilung bleibt schwierig. Denn die geringere Bildung von Matrixmaterial kann zu Lasten eines stabilen Neugewebes gehen. Außerdem hat die Wunde, wenn sie bakteriell kontaminiert ist, ohne die Einwanderung von Leukozyten kaum Abwehrmechanismen.

Potenzielle therapeutische Anwendungen

Die Aufklärung der physiologischen und pathophysiologischen Bedeutung von TGF-ß sowie der TGF-ß-Signalkaskade mit den TGF-ß-Rezeptoren und den Smad-Proteinen ist auch für die Entwicklung neuer spezifischer Arzneistoffe von Bedeutung. Sowohl TGF-ß als auch Substanzen, die dessen Stoffwechsel modifizieren oder die TGF-ß-Signalkaskade beeinflussen, kommen als Medikamente in Betracht.

So lässt sich die Beteiligung von Smad-3 an der Proliferationsregulierung von Keratinozyten eventuell für die Behandlung von hyperproliferativen Hauterkrankungen wie der Psoriasis nutzen. In der Tat findet man bei diesen Patienten häufig eine verminderte Expression der TGF-ß-Rezeptoren, sodass TGF-ß seine proliferationshemmende Wirkung nicht voll entfalten kann.

Besonders zukunftsträchtig erscheint die Regulierung der Angiogenese durch TGF-ß. Ein neu entstehendes Karzinom muss nämlich durch Angiogenese eine Verbindung zum Blutgefäßsystem herstellen, um schnell wachsen zu können. Eine Inhibierung der Angiogenese mit Hemmstoffen von TGF-ß könnte neue Wege in der Tumortherapie eröffnen.

Kastentext: Abkürzungen

• ARE: Activin Responsive Element
• ARF: Activin Responsive Factor
• BMP: Bone Morphogenetic Protein (Tab. 1)
• Co-Smad: Kooperatives Smad-Protein; bildet mit aktivierten R-Smads einen Komplex, der in den Zellkern einwandert und als Transkriptionsfaktor fungiert (Abb. 1)
• FGF: Fibroblast Growth Factor
• GDF: Growth and Differentiation Factor (s. Tab. 1)
• GDMP: Cartilage-Derived Morphogenetic Protein, eine Art GDF (s. Tab. 1)
• GDNF: Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor (s. Tab. 1)
• I-Smad: Inhibitorisches Smad-Protein; antagonisiert die Wechselwirkung von R-Smad und TGF-ß-Rezeptor oder von R-Smad und Co-Smad (s. Abb. 1)
• PDGF: Platelet-Derived Growth Factor
• R-Smad: Rezeptor-reguliertes Smad-Protein; lagert sich an den aktivierten TGF-ß-Rezeptorkomplex an und wird durch diesen phosphoryliert (Abb. 1)
• SARA: Smad Anchor for Receptor Activation Protein, ein Smad-Rezeptor (Abb. 1)
• smad: Transkriptionsfaktoren; die Bezeichnung ist eine Kombination aus Sma (Small body size, C. elegans) und Mad (Mother against decapentaplegic, Drosophila)
• SSxS: vereinfachte Schreibweise für SSV/MS (Serin-Serin-Valin/Methionin-Serin), die Aminosäurensequenz der R-Smads am C-terminalen Ende, an dem die Phosphorylierung durch die TGF-ß-Rezeptoren stattfindet (Abb. 3)
• TGF: Transforming Growth Factor

Literatur [1] Ashcroft GS, Yang X, Glick AB, Weinstein M, Letterio JL, Mizel DE, Anzano M, Greenwell-Wild T, Wahl SM, Deng C and Roberts AB (1999) Mice lacking Smad-3 show accelerated wound healing and an impaired local inflammatory response. Nat Cell Biol 1: 260 – 266. [2] Attisano L, Carcamo J, Ventura F, Weis FM, Massague J and Wrana JL (1993) Identification of human activin and TGF beta type I receptors that form heteromeric kinase complexes with type II receptors. Cell 75: 671 – 680. [3] Itoh S, Itoh F, Goumans MJ and Ten Dijke P (2000) Signaling of transforming growth factor-beta family members through Smad proteins. Eur J Biochem 267: 6954 – 6967. [4] Liu F, Pouponnot C and Massague J (1997) Dual role of the Smad4/DPC4 tumor suppressor in TGF-beta-inducible tran-scriptional complexes. Genes Dev 11: 3157 – 3167. [5] Macias-Silva M, Abdollah S, Hoodless PA, Pirone R, Attisano L and Wrana JL (1996) MADR2 is a substrate of the TGFbeta receptor and its phosphorylation is required for nuclear accumulation and signaling. Cell 87: 1215 – 1224. [6] Massague J (1998) TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem 67: 753 – 791. [7] Massague J and Wotton D (2000) Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling system. Embo J 19: 1745 – 1754. [8] Nakao A, Afrakhte M, Moren A, Nakayama T, Christian JL, Heuchel R, Itoh S, Kawabata M, Heldin NE, Heldin CH and ten Dijke P (1997) Identification of Smad7, a TGF-beta-inducible antagonist of TGF-beta signalling. Nature 389: 631 – 635. [9] Weinstein M, Yang X and Deng C (2000) Functions of mammalian Smad genes as revealed by targeted gene disruption in mice. Cytokine Growth Factor Rev 11: 49 – 58. [10] Wrana JL and Attisano L (2000) The Smad pathway. Cytokine Growth Factor Rev 11: 5 – 13. [11] Yang X, Castilla LH, Xu X, Li C, Gotay J, Weinstein M, Liu PP and Deng CX (1999) Angiogenesis defects and mesenchymal apoptosis in mice lacking SMAD-5. Development 126: 1571 – 1580. [12] Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, Roberts AB and Deng C (1999) Targeted disruption of SMAD-3 results in impaired mucosal immunity and diminished T cell responsiveness to TGF-beta. Embo J 18: 1280 – 1291.