CRISPR/Cas9

Eine merkwürdige Entdeckung

CRISPR ist nicht irgendeine verrückte Erfindung aus einem der unzähligen Genlabors. Es handelt sich vielmehr um ein physiologisches System, das es lange geschafft hat, unentdeckt zu bleiben. Dabei ist es von ungeheurer Wichtigkeit – so wichtig, dass ganz unterschiedliche Organismen dieses Prinzip benutzen. Genauer gesagt handelt es sich um eine Art Immunsystem der Eubakterien und Archae-Bakterien, die sich – ähnlich wie höher entwickelte Lebewesen – auch anstecken können und einen Mechanismus entwickelt haben, um sich gegen diese „Angreifer“ zu wehren. Die „Angreifer“ sind Bakteriophagen – keine Lebewesen also, sondern Informationspakete ähnlich den Viren, die es bekanntlich auf eukaryontische Zellen abgesehen haben.

Im Jahre 1987 publizierten Yoshizumi Ishino und Kollegen von der Osaka University in Japan eine bakterielle Sequenz, die sie iap nannten [1]. Um der Funktion dieser DNA auf die Spur zu kommen, charakterisierten sie auch Genombereiche, die diese iap-Region flankierten. Dabei fanden sie eine Sequenz mit fünf identischen Wiederholungseinheiten, die jeweils 29 Basenpaare enthielten. Diese waren wiederum durch DNA-Blöcke von jeweils 32 Basenpaaren voneinander getrennt. Solche Anordnungen kommen in DNA öfter vor, und man bezeichnet Blöcke, die charakteristische Sequenzmotive voneinander trennen, gemeinhin als Platzhalter bzw. Spacer. Jeder dieser Spacer hatte eine eigenständige Sequenz, ganz anders als die 29-Basen-Sequenzblöcke, die die Spacer von­einander trennten. Die Bedeutung ihrer Entdeckung verstanden Ishino und seine Kollegen damals jedoch noch nicht.

Als um die Jahrhundertwende das Sequenzieren von Genomen unterschiedlicher Mikroorganismen gewissermaßen industrialisiert wurde, entdeckte man in vielen der sequenzierten Organismen – konkret in Eubakterien und ­Archae-Bakterien – ganz ähnliche Genom-Anordnungen. Da war es Zeit, diesen auffälligen Strukturen einen Namen zu geben, und so „taufte“ der Niederländer Ruud Jansen von der Universität in Utrecht im Jahre 2002 diese Genom-Konstellation als clustered regularly interspaced short palindromic ­repeats (CRISPR). Zusätzlich machte die holländische Gruppe eine weitere wichtige Entdeckung: Den Wissenschaftlern fiel nämlich auf, dass sich in direkter Nachbarschaft zur CRISPR-Region Gene befanden, die sie als CRISPR-associated genes (Cas) bezeichneten.

Eine interessante Abwehrstrategie

Es dauerte noch ein paar Jahre, bis bei Sequenzvergleichen auffiel, dass die Spacer-Sequenzen verblüffende Übereinstimmungen mit Phagen-Sequenzen zeigten. Und so wurde recht schnell die Hypothese geboren, dass das CRISPR/Cas-System eine weitere, bisher unbekannte Variante eines bakteriellen Abwehrsystems – quasi ein primitives Immunsystem – repräsentieren könnte.

Könnte es sein, so die Hypothese, dass die Cas-Enzyme bei einer Infektion eines Bakteriums mit einem Bakteriophagen einen Teil der Phagen-DNA ausschneiden und diese dann in ihre CRISPR-Region inserieren würden? Damit wäre gewissermaßen ein Infektionsgedächtnis etabliert, quasi ein Analogon zu unserem spezifischen Immunsystem, das bei einer erneuten Infektion von Nutzen sein könnte. Dass sich Bakterien gegen Fremd-DNA wehren können, ist längst bekannt. Eines der prominentesten Beispiele sind die Restriktionsenzyme, die eine Phagen-DNA dadurch erkennen, dass sie im Gegensatz zur bakteriellen DNA an den Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuklease nicht modifiziert ist und folglich geschnitten wird. Im Falle von CRISPR/Cas ist die Situation ähnlich, aber dann doch auch deutlich anders.

Von CRISPR-RNA gesteuerte Endonuklease Cas9 – Ein komplexer Mechanismus …

Um den spezifischen Zerstörungsmechanismus gegen eingedrungene Phagen in Gang zu bringen, werden zunächst Transkripte von CRISPR-Blöcken zu CRISPR-RNAs prozessiert (crRNAs). Jede dieser RNAs besteht aus einer variablen Sequenz, der „Spacer“-Sequenz, die von einem Phagen stammt, der einmal die Zelle infiziert hatte, und aus einem Teil der identischen CRISPR-Wiederholungseinheiten. Die crRNAs hybridisieren mit einer zweiten RNA, der sogenannten transaktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA). Diese beiden RNAs bilden dann schließlich einen Komplex mit der Cas-Nuklease.

Infiziert ein Phage eine mit einem CRISPR/Cas-System geschützte Zelle, so dirigiert die Spacer-Sequenz in der crRNA die Cas-Nuklease zu der komplementären Phagen-DNA. Befindet sich neben dem 5’-Ende der Protospacer-Sequenz eine sogenannte PAM-Sequenz (protospacer adjacent motif) auf der Phagen-DNA, hydrolysiert die Cas-Endonuklease an dieser Stelle die DNA des Eindringlings. Die Spacer-Sequenzen, die ja auch im CRISPR-Locus auf dem Bakterien-Genom vorhanden ist, wird nicht zerstört, da sie sich nicht neben einer PAM-Sequenz befindet.

… und seine Vereinfachung für die Praxis

Das am weitesten eingesetzte CRISPR/Cas-System ist das CRISPR/Cas9-System aus Streptomyces pyogenes. Dieses System wurde für ein gezieltes Genom-Editing in vielfältiger Weise angepasst. In seiner einfachsten und am weitesten verbreiteten Form werden zwei Komponenten verwendet, die in den Organismus eingebracht werden müssen, dessen DNA punktgenau verändert werden soll. Dies ist einmal das Gen für die Cas9-Endonuklease und zum anderen eine sogenannte Führungs-RNA (guide RNA/gRNA). Diese besteht aus einer Fusion einer speziell ausgewählten crRNA und einer konstanten tracrRNA (Abb. 1B). Die Cas9-Nuclease spaltet die Ziel-DNA dann, wenn die Protospacer-DNA an ihrem 5’-Ende neben einer PAM-Sequenz liegt. Diese besitzt in der üblichen Form die Sequenz 5’-NGG. Man kann sich leicht vorstellen, wie flexibel dieses System einsetzbar ist. In der Ziel-DNA muss man nur eine 5’NGG-PAM-Sequenz identifizieren und von da aus eine komplementäre Spacer-RNA synthetisieren, der dann die konstanten Bereiche der gRNA folgen.

Die bemerkenswerte Vielfalt der Anwendungsmöglichkeiten des CRISPR/Cas-Systems

Nachdem im Jahre 2009 erstmals die Flexibilität dieses ausgeklügelten bakteriellen Immunsystems gezeigt worden war, folgte eine große Zahl von Publikationen, in denen die Anwendung in allen möglichen Organismen demonstriert wurde. Dies betraf nicht nur die Genome von Mikroorganismen und Zellkulturzellen, sondern auch die Genome ganzer Organismen, darunter u. a. Hefe, Tabak, Reis, Weizen, Maus, Ratten, Kaninchen, Frosch, Drosophila, Zebrafisch und auch das menschliche Genom ließen sich spezifisch editieren. Die Möglichkeiten der genetischen Veränderungen sind zudem extrem vielfältig. So kann man bestimmte Sequenzen an bestimmten Stellen eliminieren. Man kann aber auch Sequenzen einfügen oder DNA-Regionen beispielsweise mit leuchtenden Proteinen für die Mikroskopie markieren. Schließlich lassen sich auch Genomregionen aktivieren, die in bestimmten Zellen inaktiv vorliegen. Dazu wurden u. a. spezielle ­Varianten der Cas9-Endonuklease entwickelt, die bei ganz bestimmten Problemstellungen zu sehr differenzierten ­Lösungen führen können. Diese unglaublich schnelle Verbreitung des CRISPR/Cas-Systems wurde auch dadurch möglich, dass viele Komponenten der Cas9-Technologie durch open-source-Distributoren wie Addgene zu Verfügung gestellt wurden und dass sich Anwender in Foren wie www.genome-engineering.org oder www.egenome.org rege austauschten.