K. Westerhoff und MitarbeiterJohanniskrautextrakt-Pr

Qualität, Wirksamkeit und Unbedenklichkeit von Phytopharmaka

Für Phytopharmaka gelten in Deutschland die rechtlichen Bestimmungen des Arzneimittelgesetzes. Damit muss ein pflanzliches Arzneimittel grundsätzlich die gleichen Anforderungen für die Zulassung erfüllen wie ein Arzneimittel mit chemisch definiertem Arzneistoff. Hauptkriterien für die Zulassung sind neben der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit vor allem auch die pharmazeutische Qualität des Arzneimittels.

Das Qualitätskriterium Chargenkonformität eines Arzneimittels dient primär der Sicherung von Wirksamkeit und Unbedenklichkeit. In vorangegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Forderung nach einer konstanten Extraktzusammensetzung bei Johanniskrautextrakt-Präparaten – besonders im Hinblick auf die Hyperforingehalte – trotz der natürlichen Schwankungsbreite der Inhaltsstoffe pflanzlicher Extrakte von einigen Präparaten erfüllt wird [4].

Freisetzung des Wirkstoffes – Spezifikationen

Neben der Gleichförmigkeit des Gehaltes an Wirkstoff(en) hat auch die reproduzierbare Freisetzung der Wirksubstanz(en) aus der Arzneiform einen entscheidenden Einfluss auf die Wirksamkeit des Präparates, da die Freisetzung eine wichtige Voraussetzung für die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes darstellt. Die Freisetzung aus festen, einzeldosierten Darreichungsformen zur oralen Applikation wird in vitro durch Dissolutionstests bestimmt.

Für Fertigarzneimittel mit chemisch definierten Arzneistoffen gibt es Spezifikationen bezüglich der Freisetzung des Wirkstoffes aus unterschiedlichen Darreichungsformen. So sollte im Falle der "schnellfreisetzenden Arzneiformen" mit hochlöslichen Wirkstoffen gewährleistet sein, dass der enthaltene Wirkstoff innerhalb von 20 bis 30 Minuten zu 80% freigesetzt wird [5].

Wirkstoffe von Phytopharmaka

Der Wirkstoff in Phytopharmaka ist der pflanzliche Extrakt, ein sehr komplexes Substanzgemisch, dessen Zusammensetzung von verschiedenen Faktoren wie z. B. der natürlichen Variabilität des Pflanzenmaterials, dem Anbau, der Erntezeit, der Trocknung und Lagerung und dem Extraktionsprozess inklusive der Art des Auszugsmittels abhängt [6]. Um eine gleichbleibende Qualität der Extrakte und somit der Präparate zu gewährleisten, sollten der Arzneipflanzenanbau sowie die Extraktions- und Herstellungsverfahren möglichst unter standardisierten Bedingungen erfolgen.

Nach dem Entwurf einer Extrakt-Monographie für den Allgemeinen Teil des Europäischen Arzneibuches, der in modifizierter Form in den 1. Nachtrag zur 4. Ausgabe des EuAB (2002) aufgenommen werden soll, können Pflanzenextrakte und Tinkturen in drei Kategorien eingeteilt werden [7]:

• Typ A: "Standardised extracts", für Pflanzen, deren wirksamkeitsbestimmende Inhaltsstoffe bekannt sind, z. B. Eingestellter Sennesblättertrockenextrakt EuAB.
• Typ B: "Quantified extracts", für Pflanzen, deren Wirkprinzip nicht vollständig geklärt ist, für die aber wirksamkeitsmitbestimmende Substanzen bekannt sind, z. B. Eingestellter Ginkgotrockenextrakt DAB. Extraktmonographien dieses Typs fehlen im EuAB, im 1. Nachtrag 2002 werden jedoch entsprechende Monographien von Johanniskraut und von Weißdornblättern mit Blüten vertreten sein.
• Typ C: Andere Extrakte, für Pflanzen, bei denen die Wirkung noch keinem Inhaltsstoff zugeordnet werden kann.

Dissolutionstests für Phytopharmaka

Für Extrakte des Typs A muss im Rahmen der Zulassung die Freisetzung der wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe aus der Darreichungsform nachgewiesen werden. Nach der "Note for Guidance on Specifications: Test procedure and acceptance criteria for herbal drugs, herbal drug preparations and herbal medicinal products" der EMEA (EMEA/CVMP/815/00), die im Januar 2002 in Kraft treten soll, kann jedoch für Präparate, die schnell zerfallen und im physiologischen pH-Bereich leicht lösliche Wirkstoffe enthalten, der Nachweis des Tablettenzerfalls ausreichend sein.

Für Präparate, deren wirksamkeitsbestimmende Substanzen nicht oder nur zum Teil bekannt sind, ist eine Untersuchung der Freisetzung von Inhaltsstoffen zwar nicht zwingend vorgeschrieben. Nach unserer Meinung ist aber bei Extrakten der Kategorie B die Untersuchung des Freisetzungsverhaltens von wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen sinnvoll, zumal damit Aussagen über die pharmazeutisch-galenische Qualität der einzelnen Präparate und gegebenenfalls auch Voraussagen zur Bioverfügbarkeit der wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe möglich sind.

Inhaltsstoffe von Johanniskraut

Johanniskraut ist eine bezüglich ihrer Inhaltsstoffe und Wirkung sehr gut charakterisierte Arzneipflanze. Während aber die klinische Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten in kontrollierten Untersuchungen zweifelsfrei belegt werden konnte, ist die Frage nach dem pharmakologischen Wirkmechanismus des Johanniskrautextraktes und damit die Frage nach den antidepressiven Wirkprinzipien trotz intensiver Forschungsbemühungen noch nicht vollständig geklärt. Dementsprechend werden Johanniskrautextrakte der Kategorie B zugeordnet. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des alkoholischen Auszugsmittels enthalten sie eine Vielfalt von Inhaltsstoffen, wie z. B. Flavonoide, Biflavone, Phenylpropane, Naphthodianthrone und Acylphloroglucinole.

Für das Phloroglucinderivat Hyperforin, das zu 2 bis 5% im Extrakt enthalten ist, wurde die Beteiligung an der Gesamtwirkung zweifelsfrei durch zahlreiche pharmakologische Untersuchungen belegt [8]. Im Hinblick auf die Chargenkonformität einzelner Johanniskrautextrakt-Präparate sollte dieser Inhaltsstoff deshalb in reproduzierbaren Konzentrationen enthalten sein.

Charakteristik und Hyperforingehalte der Präparate

Am Beispiel von fünf ausgewählten apothekenpflichtigen Johanniskrautextrakt-Präparaten des deutschen Arzneimittelmarktes haben wir das Freisetzungsverhalten von Hyperforin in FeSSIF (Fed State Simulated Intestinal Fluid) [9] untersucht (Tab. 1).

Bei drei der fünf Arzneimittel handelte es sich um Filmtabletten, bei einem um Dragees und bei einem weiteren um Kapseln. Drei Präparate enthielten jeweils 300 mg Johanniskrauttrockenextrakt (P1, P2, P3), die anderen 425 mg (P4) bzw. 612 mg (P5). Als Auszugsmittel der für die Herstellung der Arzneimittel verwendeten Trockenextrakte wurde in zwei Fällen 60%iges Ethanol angegeben (P2, P4), bei zwei Präparaten 80%iges Methanol (P1, P3) und bei einem weiteren Präparat 50%iges Ethanol (P5).

Zur Bestimmung des Hyperforingehaltes wurde jeweils ein Mischmuster der untersuchten Präparate unter Anwendung eines validierten HPLC-Verfahrens analysiert. Vier der fünf untersuchten Präparate enthielten im Schnitt Mengen von 2,5 bis 3,3% Hyperforin im Extrakt. Den höchsten prozentualen Gehalt an Hyperforin enthielt das Präparat P2.

Auswahl des Dissolutionsmediums

Werden für die Freisetzungsuntersuchungen die zur Qualitätskontrolle verwendeten kompendialen Medien (z. B. Salzsäure pH 1,2 oder Phosphatpuffer pH 6,8) eingesetzt, kann besonders die Freisetzung von lipophilen Wirkstoffen erhebliche Probleme bereiten. Dies gilt auch für das lipophile Hyperforin, das in wässrigen Lösungsmitteln nahezu unlöslich ist. In einem Vorversuch wurde seine Freisetzung zunächst in SGFsp (Simulated Gastric Fluid sine pepsin) gemäß USP 24 durchgeführt. Die Analyse der Proben zeigte, dass es unter den sauren Bedingungen des Magensaftes zu keiner Freisetzung von Hyperforin kommt.

Darauffolgend wurde das Freisetzungsverhalten von Hyperforin im biorelevanten Medium FaSSIF (Fasted State Simulated Intestinal Fluid) untersucht. Dieses Medium simuliert die Flüssigkeit im proximalen Dünndarm im nüchternen Zustand im Hinblick auf pH-Wert, Osmolalität und Konzentration der Gallenkomponenten. Auch unter diesen Bedingungen erfolgte nur eine geringfügige Freisetzung von Hyperforin. In weiteren Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der Konzentration an Gallenbestandteilen zu einer Erhöhung der Freisetzungsrate von Hyperforin führt. Das Medium FeSSIF (s. o.) simuliert die Eigenschaften der proximalen Dünndarmflüssigkeit im postprandialen Zustand hinsichtlich pH-Wert, Osmolalität und Konzentration der Gallenbestandteile; sie bildete die Grundlage für den Vergleich der Hyperforinfreisetzung aus den fünf Präparaten P1 bis P5 (Abb. 1).

Ergebnisse

Was die Geschwindigkeit und den Umfang der Freisetzung von Hyperforin in FeSSIF anbelangt, so zeigte das Präparat P3 die schnellste und vollständigste Freisetzung des Wirkstoffes. Innerhalb der ersten 5 bis 7 Minuten waren die Tabletten zerfallen und nach 45 Minuten mehr als 60% des im Extrakt enthaltenen Hyperforins freigesetzt. Am Ende des Untersuchungszeitraumes von 240 Minuten, entsprechend der Passagezeit durch den Dünndarm, befanden sich nahezu 100% des im Extrakt enthaltenen Hyperforins in Lösung.

Im Vergleich dazu erfolgte die Freisetzung des Hyperforins aus den Präparaten P2 und P5 langsamer und weniger vollständig. Nach 45 Minuten waren ca. 20%, nach 120 Minuten mehr als 50% und nach 240 Minuten mehr als 80% des jeweils enthaltenen Hyperforins gelöst.

Im Falle des Präparates P4 begann sich die Kapselhülle nach 3 Minuten zu öffnen, der Extrakt verteilte sich allerdings sehr langsam im Medium: Nach 45 Minuten waren etwa 10% des enthaltenen Hyperforins gelöst, nach 240 Minuten knapp 50%.

Beim Präparat P2 waren die Drageekerne auch nach 240 Minuten Untersuchungsdauer noch nicht vollständig zerfallen. Sie waren außen gequollen, besaßen allerdings noch einen festen Kern. Unter den gewählten Testbedingungen trat die Freisetzung von Hyperforin nur sehr verzögert und unvollständig ein: Nach 120 Minuten waren erst knapp 10% und bei Beendigung der Untersuchung lediglich 20% des enthaltenen Hyperforins freigesetzt.

Diskussion

Nach dem Monographie-Entwurf für das Europäische Arzneibuch gehören Johanniskrautextrakte zur Extraktkategorie Typ B, bei denen das wirksamkeitsgebende Prinzip nicht vollständig geklärt, für die aber wirksamkeitsmitbestimmende Inhaltsstoffe bekannt sind. Die maßgebliche Beteiligung von Hyperforin an der antidepressiven Gesamtwirkung des Johanniskrautes ist unstrittig, weshalb auch die In-vitro-Überprüfung der Freisetzung von Hyperforin aus festen Arzneiformen zwar (noch) nicht zwingend vorgeschrieben, aber doch ein wichtiger Bestandteil der Prüfung der pharmazeutischen Qualität ist.

Für Arzneimittel mit synthetischen Wirkstoffen aus der Klasse der "schnellfreisetzenden Arzneiformen" gilt, dass der enthaltene Wirkstoff innerhalb von 20 bis 30 Minuten zu 80% freigesetzt werden soll. Für Phytopharmaka wird eine 80%ige Freisetzung des Wirkstoffes (Gesamtextrakt oder einzelne Inhaltsstoffe) nach 60 Minuten als ein realisierbarer und anzustrebender Wert angesehen [10]. Nach unserer Meinung ist eine 80%ige Freisetzung nach 120 Minuten akzeptabel, wenn es sich um lipophile, schwer lösliche Wirkkomponenten handelt. Entsprechend einer durchschnittlichen Dünndarmpassagezeit von 4 Stunden verbliebe ausreichend Zeit für die Resorption des Wirkstoffes. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass dieses Kriterium nur von einem Präparat (P3) erfüllt wird.

In diesem Zusammenhang ist ein früher erhobener Befund von Interesse: Demnach führte die Gabe des Präparates P3 im Vergleich zu P1 zu einem signifikant deutlicheren und schnelleren Anstieg der alpha-2-Aktivität im Gehirn (die Aktivität der alpha-2-Wellen weist auf eine stimmungsaufhellende Wirkung hin) [11]. Ein Zusammenhang zwischen rascher Freisetzung des Wirkstoffes und pharmakologischem Wirkungseintritt erscheint realistisch, bedarf allerdings noch weiterer Überprüfung.

Material und Methoden

Die untersuchten Johanniskrautextrakt-Präparate wurden aus einer Apotheke in der Nähe von Frankfurt/Main bezogen.

Dissolutionstest Die Dissolutionstests wurden mit Apparatur 2 der USP (Paddle-Apparatur) bei einer Temperatur von 37 ± 0,5 °:C durchgeführt. Die Temperatur des Mediums in den Gefäßen wurde mit einem Thermometer gemessen und protokolliert. Es wurden jeweils 500 ml Dissolutionsmedium verwendet. Die gesamte entnommene Probenmenge war in allen Fällen gemäß den Anforderungen weniger als 10% des zur Verfügung stehenden Dissolutionsmediums. Es wurde bei allen Versuchen eine Umdrehungsgeschwindigkeit von 100 rpm gewählt. Zur Vermeidung von Verdunstungsverlusten waren die Dissolutionsgefäße während der Aufheiz- und der Betriebsphase zugedeckt.

5-ml-Proben wurden zu festgelegten Zeitpunkten mit einer Glasspritze mit Lüer-Lock-Anschluss entnommen und jeweils durch ein gleiches Volumen an Dissolutionsmedium, das in einem separaten Vessel bei einer Temperatur von 37 ± 0,5 °C aufbewahrt wurde, ersetzt. Am Ende der Entnahmevorrichtung befand sich eine Filterfritte mit einem Porendurchmesser von 10 µm, um größere ungelöste Partikel zurückzuhalten. Die wässrigen Proben wurden zur Durchführung der Analysen durch PTFE-Filter (Rezist 30/0,45; Schleicher und Schuell) mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm filtriert, wobei die ersten 2 ml verworfen wurden und nachfolgend ca. 1,2 ml in Braunglas-HPLC-Vials abgefüllt wurden. Die Proben wurden nach der Entnahme auf Raumtemperatur abgekühlt und ohne weitere Vorbereitung der Analyse zugeführt.

Die Freisetzungsuntersuchungen wurden 3fach parallel mit einer Einzeldosis pro Freisetzungsgefäß durchgeführt. Wegen der Labilität von Hyperforin unter Lichteinfluss wurden die Dissolutionstests unter Ausschluss von Tageslicht durchgeführt.

Zusammensetzung und Herstellung des Freisetzungsmediums FeSSIF (Fed State Simulated Intestinal Fluid), das 15 mmol/l Natriumtaurocholat (NaTC) und 3,75 mmol/l Lecithin enthält, einen pH-Wert von 5,00 und eine Osmolalität von 670 mosm/kg hat, wurde wie folgt hergestellt: FeSSIF-Puffer, bestehend aus 8,08 g NaOH-Rotuli, 17,3 g Eisessig, 30,4 g Kaliumchlorid und demineralisiertem Wasser (ad 2 l), wurde mit 1N NaOH auf pH 5,00 eingestellt.

16,5 g NaTC wurden in ungefähr 450 ml des FeSSIF-Puffers gelöst. Anschließend wurden 59,08 ml einer 10%igen Lecithin-Lösung in Chloroform hinzugefügt, wobei sich eine milchig trübe Emulsion bildete. Das Chloroform wurde mithilfe eines Rotationsverdampfers mit dazugehöriger Membranpumpe und Vakuum-Controller bei ca. 40 Grad Celsius im Wasserbad entfernt (15 min bei 400 mbar und weitere 15 min bei 200 mbar). Es entstand eine klare mizellare Lösung, die keinen Geruch mehr nach Chloroform aufwies. Mit FeSSIF-Puffer wurde nach Abkühlung der mizellaren Lösung auf Raumtemperatur dann auf 2 Liter aufgefüllt.

Probenaufarbeitung – Gehaltsbestimmung Das Gewicht von zehn Einzeldosen des jeweiligen Präparates wurde ermittelt und anschließend mithilfe einer Analysenmühle (3 x 10 s) ein homogenes Mischmuster aus diesen zehn hergestellt. Die etwa dem Gewicht einer Einzeldosis entsprechende Menge des Mischmusters wurde zur weiteren Aufarbeitung in einen 50-ml-Messkolben eingewogen. Der Messkolben wurde mit 80%igem Ethanol bis zur Eichmarke aufgefüllt. Die Mischung wurde verschlossen für 10 Minuten im Ultraschallbad bei Raumtemperatur extrahiert. Der Inhalt des Messkolbens wurde in ein Becherglas umgefüllt und unter Zuhilfenahme einer 5-ml-Glasspritze und 0,45-Mikrometer-Filtern (Hydrophile Polypropylenfilter; Pall Gelmann) in zwei Braunglas-HPLC-Vials filtriert (Analyse/ Rückstellmuster).

HPLC Das HPLC-System für die Hyperforin-Analytik bestand aus Pumpen des Herstellers Rainin (Vertrieb Varian, Darmstadt) Typ SD-200 mit Druckmodul (bis 4000 psi) und dynamischem Mischer, einem Dynamax Detektor (Vertrieb Varian) Typ UV D II und dem Autosampler (Varian Pro Star); zur Steuerung/Auswertung wurde die Star Chromatography Workstation Software Version 5.2 von Varian verwendet.

Die Auftrennung erfolgte bei Raumtemperatur nach Injektion von 20 Mikroliter Probe auf einer Merck LiChrospher 100 RP-8 Säule, 5 Mikrometer, 125 x 4 mm. Die isokratische Elution erfolgte mit einem Fließmittelgemisch aus Phosphatpuffer (A) (Millipore-Wasser, Milli-Q-Filtersystem mit Leitfähigkeitsüberprüfung, pH = 2.1, eingestellt mit Phosphorsäure) und Acetonitril (B) (Merck, LiChrosolv, Acetonitril gradient grade Bestellnr. 1.00030.2500). Der Fluss betrug 1 ml/min. Detektiert wurde bei 270 nm. Die Bestimmung des Hyperforingehaltes erfolgte mit externer Standardeichgerade. Referenzsubstanz: Hyperforin als Dicyclohexylammonium-Salz; Lagerung bei 4 bis 6 °C. Die einzelnen Proben wurden doppelt bestimmt.

Kastentext: Zusammenfassung

• Die Untersuchungen zur Freisetzung von Hyperforin offenbaren ebenso wie die Untersuchungen zur Chargenkonformität, dass die verschiedenen Johanniskrautextrakt-Präparate zur Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen nicht ohne weiteres untereinander austauschbar sind.
• Aufgrund der zum Teil erheblichen Unterschiede im Gehalt an wirksamkeitsmitbestimmenden Substanzen und der unterschiedlichen Freisetzung von Hyperforin im In-vitro-Test sind demnach auch die Ergebnisse aus klinischen Studien einzelner Präparate nicht auf andere Präparate übertragbar.

Kastentext: Literaturtipp

Johanniskraut, Botanik - Inhaltsstoffe - Qualitätskontrolle - Pharmakologie - Toxikologie und Klinik. Handbuch für Ärzte, Apotheker und andere Naturwissenschaftler. Von Dr. Ravindernath Kaul, 187 Seiten, 67 s/w-, 13 vierfarbige Abbildungen, 38 Tabellen. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart 2000. Gebunden. 7 29,70. ISBN 3-8047-1704-7

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