Pharmazeutische Technologie: Strategien für eine effiziente Arzneimittelentwick

Endozytose von Liposomen

Als Endozytose bezeichnet man die Aufnahme von Material in das Innere einer Zelle mit Hilfe von Vesikeln, die sich an der Membran bilden. Die heute am besten verstandene Form ist die Clathrin-abhängige Endozytose, welche durch ihren ersten Schritt, die Internalisierung von extrazellulärem Material an den Clathrin-coated Pits der Plasmamembran, charakterisiert ist.

Bei der Caveolae-abhängigen Endozytose spielt das Protein Caveolin eine bedeutende Rolle, und die Clathrin-independent pathways nehmen Material weder über Clathrin-coated pits noch über Caveolae auf. Einige spezialisierte Zellen sind darüber hinaus in der Lage, große Mengen an extrazellulärem Fluid via Makropinozytose oder große Partikel über Phagozytose aufzunehmen.

Um die Aufnahme von Liposomen zu charakterisieren, setzt man eine Kombination aus verschiedenen Endozytoseinhibitoren ein, welche mehr oder weniger selektiv einzelne Aufnahmewege hemmen. Beispielsweise hemmt das Makrolid-Antibiotikum Filipin selektiv die Caveolae-abhängige Endozytose, während Chlorpromazin ausschließlich die Internalisierung via Clathrin-abhängiger Endozytose verhindert.

Weiterhin stehen für jeden Aufnahmeprozess Modellsubstanzen zur Verfügung, welche selektiv über einen der Mechanismen internalisiert werden. Nach Inkubation dieser Modellsubstanzen mit Fluoreszenz-markierten Liposomen und verschieden Zellmarkern (zur Anfärbung von Zellkern, Lysosomen, Zellmembranen, Golgi-Apparat etc.) wird mittels Spectral Bio-Imaging auf Kolokalisation geprüft, um weitere Aussagen über den Aufnahmemechanismus und das Schicksal von Liposomen in der Zelle zu erhalten.

Das Spectral Bio-Imaging ermöglicht es, von jedem Bildpunkt eines zweidimensionalen Bildes ein komplettes Spektrum von emittiertem Licht zu messen. Dies ist die Voraussetzung für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer spektralähnlicher Fluoreszenzfarbstoffe (U. Huth, R. Schubert, R. Peschka-Süss).

Drug-Targeting durch Funktionalisierung von Liposomen

Liposomale Arzneistoffträgersysteme zeichnen sich durch eine verbesserte therapeutische Effizienz bei gleichzeitiger Reduzierung der unerwünschten Wirkungen aus. Aufgrund der Wechselwirkung konventioneller Liposomen mit Plasmaproteinen (Opsoninen) kommt es jedoch zu einer raschen Eliminierung der Vesikel aus der Blutbahn und damit zu einer weitreichenden Einschränkung der therapeutischen Anwendbarkeit von Liposomen.

Die Modifizierung der Bilayer mit Hilfe synthetischer Polyethylenglykol-Phospholipid-Derivate hat zu einer dramatischen Verlängerung der Plasmahalbwertszeit von Liposomen geführt und damit das therapeutische Potenzial liposomaler Zubereitungen entscheidend erweitert.

Zusätzlich haben die pegylierten Lipide (PEG-Lipide) die Möglichkeit, nach der chemischen Aktivierung ihrer terminalen Hydroxylgruppe kovalente Bindungen mit Peptiden oder Proteinen einzugehen, deren Zielstrukturen charakteristisch für pathologisch verändertes Gewebe sind. Auf diese Weise konnte in vivo und in vitro ein aktives Drug Targeting erreicht werden.

Durch die Tatsache, dass die bislang verwendeten PEG-Lipid-Derivate bereits bei der Herstellung der Liposomen in die Lipidmembranen eingebracht werden müssen, erfährt dieser hoffnungsvolle Ansatz jedoch einen entscheidenden Rückschlag, da die Interaktion der aktivierten PEG-Lipide mit anderen Membrankomponenten, Puffersystemen oder Wirkstoffen zu deren Inaktivierung führen kann.

Eine nachträgliche Funktionalisierung vorgefertigter Liposomen vermeidet die Probleme während der Herstellung und vereinfacht die Arbeitsschritte zu deren Darstellung. Die konventionellen aktivierten PEG-Phospholipide eignen sich allerdings nur bedingt für einen solchen Herstellungsgang, da sie sich nur bei erhöhten Temperaturen (60 °C) in die Liposomenmembranen einlagern.

Aktivierte PEG-Sterole lagern sich bereits bei Raumtemperatur in bestehende Lipidmembranen ein und werden zurzeit auf ihre Eignung als kostengünstige Alternative zum Drug-Targeting durch Funktionalisierung von vorgefertigten Liposomen untersucht (T. Steenpaß, R. Schubert).

Großtechnische Herstellung von lipidhaltigen Gentransfer-Systemen

Die Gentherapie eröffnet neue Möglichkeiten zur Behandlung von vielen bis heute nicht behandelbaren vererbten und erworbenen genetischen Defekten. Nicht-virale Transfektionsreagenzien wurden zu vielversprechenden Alternativen der viralen Vektoren, die zwar effizienter, aber mit ernsthaften Gesundheitsproblemen behaftet sind und deren Aufreinigung und großtechnische Herstellung eine große Herausforderung darstellt.

Zur Ermittlung eines Transfektionsreagenzes, das genetisches Material effizient in Zellen einzubringen vermag sowie eine möglichst geringe Toxizität und hohe Lagerstabilität aufweist, wurden Untersuchungen mit verschiedenen Substanzen an unterschiedlichen Zellmodellen durchgeführt.

Für den Scale-up-Versuch wurde das Reagenz DAC-30, eine Kombination aus einem kationischen Cholesterolderivat und dem neutralen Lipid DOPE, ausgewählt. DAC-30 wurde an ein GFP-exprimierendes Plasmid gebunden.

Zur Herstellung großer Mengen lagerfähiger Lipoplexe wurden DNA und Liposomen in einem Pumpsystem unter sterilen Bedingungen kontinuierlich zusammengemischt und die entstandenen Lipid/DNA-Kondensate anschließend lyophilisiert.

Verschiedene Parameter des Herstellungsprozesses wurden variiert und die Auswirkungen auf die Lipoplexe untersucht. Die Transfektionseffizienz wurde mit Durchflusszytometrie quantifiziert, die Größe der Lipoplexe mittels Photonen-Korrelations-Spektroskopie analysiert und die Zellvitalität durch Quantifizierung des ATP-Gehaltes bestimmt.

Es konnte gezeigt werden, dass Lipoplexe mit guten Transfektionseigenschaften, vertretbarer Toxizität und hoher Lagerstabilität in großem Maßstab hergestellt werden können. Die biologische Aktivität der Lyophilisate blieb über den bisher untersuchten Zeitraum von 1,5 Jahren erhalten (J. Clement, K. Kiefer, P. Garidel, R. Peschka-Süss).

Neues lösungsmittelfreies Coating-Verfahren

Heutige Coating-Verfahren beruhen auf wässrigen bzw. organischen Lösungsmittelsystemen. Problematisch sind hier Emissionen flüchtiger organischer Verbindungen (VOC) und Explosionsgefahr bei organischen Lösungsmitteln, verlängerte Prozesszeiten oder geringere Stabilität des Wirkstoffes bei wasserbasierten Systemen. Durch die Entwicklung eines lösungsmittelfreien Verfahrens könnte man diese Probleme gegebenenfalls lösen.

Es wurde zunächst das Verhalten verschiedener Polymerpulver/Weichmachermischungen untersucht. Dafür wurde eine spezielle Folie auf einem Zylinder fixiert, der kontinuierlich an verschiedenen Pulverzuführeinheiten (Schwingrinne, Schneckendosierer oder Corona-Pulverdüse) und einer Sprühdüse zur Zufuhr verschiedener, flüssiger Weichmacher vorbeirotierte.

Die auf der Folie erhaltenen homogenen Polymerpulver/Weichmachermischungen wurden auf einer Heizplatte mit einem konstanten Temperaturgradienten von 25 bis 80 °C aufgebracht. Die Verfilmung beginnt beim wärmeren Teil der Heizplatte und kommt auf dem Weg zum kälteren Teil zum Stehen, wobei für eine definierte Polymer/Weichmacherkombination die Temperatur und die Zeit definiert sind.

Wir nennen sie die Minimale Verfilmungstemperatur (MVT; im Unterschied zur Minimalen Filmbildetemperatur MFT der wässrigen Latices) und die MVT-Einpendelzeit. Diese Beobachtungen sind, wie wir annehmen, damit zu begründen, dass der Weichmacher temperaturabhängig schneller oder langsamer in das Polymerpulver eindringt.

Erst danach kann oberhalb der MVT eine Verfilmung stattfinden. Die MVT sank mit steigender Menge Weichmacher, die MVT-Einpendelzeit blieb jedoch weitgehend unberührt. Abschließend wurden erneut nach obigem Verfahren Proben erstellt und diese bei der MVT über die MVT-Einpendelzeit bebrütet.

Die gewünschte Funktionalität der erhaltenen Filme konnte in einer Franz Diffusionszelle festgestellt werden. Mit einer der geprüften Kombinationen sollen nun nach obigem Verfahren Pellets in industrieüblichen Anlagen befilmt werden und mit den in einem wässrigen Verfahren gewonnen Präparaten verglichen werden (S. Engelmann, J. Betzing, R. Schubert).

Bakteriell abbaubare Hilfsstoffe für das Colon-Targeting

Beim Colon-Targeting wird ein Arzneistoff nach oraler Verabreichung durch spezielle Verfahren gezielt im Dickdarm freigesetzt. Die Methode ist von besonderem Interesse für Arzneistoffe zur Behandlung von Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und kolorektalem Karzinom. Vorteilhaft ist die bessere Compliance der Patienten im Vergleich zur rektalen Wirkstoffapplikation.

Ein Colon-Targeting kann durch pH-, Zeit-, Druck- oder Enzym-kontrollierte Wirkstofffreisetzung erreicht werden. Bei der Enzym-kontrollierten Wirkstofffreisetzung wird die relativ hohe Besiedlung des Colons mit Bakterien (ca. 109 Bakterien mehr als im Dünndarm) genutzt, deren Enzyme die Überzugsmaterialien der Tabletten oder Pellets abbauen, sodass der Wirkstoff freigesetzt wird.

Wir arbeiten an der Optimierung ≠-Cyclodextrin- und ≠-Cyclodextrin-Derivat-haltiger Filmrezepturen, mit denen wir Pellets überziehen. Erfolge verspricht man sich auch von Stärkederivaten, z.B. Natriumcarboxymethylstärke, oder anderen Polysacchariden wie Glucomannan (A. Al Raghban, R. Schubert, K.H. Bauer).

Effiziente Arzneimittelentwicklung

Im abschließenden Hauptvortrag stellte Dr. Axel Knoch, Product & Process Development, Pfizer GmbH, Freiburg, Strategien für eine effiziente Arzneimittelentwicklung vor. Etwa eine Million US Dollar an Umsatz gehen den pharmazeutischen Unternehmen täglich verloren, wenn sie einen so genannten Blockbuster später als geplant in den Markt einführen. Alle Firmen arbeiten deshalb daran, die Entwicklungszeit für neue Arzneimittel zu verkürzen.

Aufgrund der hohen Anforderungen an die Sicherheit und die Qualität der Arzneimittel und der entsprechenden Auflagen der Gesundheits- und Zulassungsbehörden ist eine Beschleunigung der Entwicklung im Bereich der präklinischen und klinischen Prüfung kaum möglich. Einen Ansatzpunkt, die Gesamtentwicklungsdauer zu verkürzen, bietet jedoch die Phase der Produkt- und Prozessübertragung aus der Entwicklung in die Produktion.

Mit der Fusion großer Pharmaunternehmen sind riesige Organisationen mit jeweils mehreren Forschungs- und Entwicklungsstandorten entstanden. Die Produktionsstätten sind weltweit verstreut. Daher findet die Produktübertragung nur noch ganz selten innerhalb eines Standorts statt. Hinzu kommt, dass die Organisationsstruktur in pharmazeutischen Unternehmen mit ihrer klaren Trennung von Forschung & Entwicklung und Produktion per se eine reibungsfreie Produktübertragung nicht fördert.

Eine organisationsübergreifende Zusammenarbeit ist bei Pfizer der Co-Development Prozess, mit dem F&E und Produktion gemeinsam neue Produkte entwickeln, in die Produktion übertragen, zur Zulassung bringen und in den Markt einführen. Die wichtigsten am Co-Development Prozess beteiligten Teams sind das Wirkstoff- und das Product-Co-Development Team sowie das Co-Development Management Team.

Ein Herstellungsprozess, z. B. einer Filmtablette, ist in der Regel diskontinuierlich und setzt sich aus verschiedenen Grundoperationen zusammen (Feuchtgranulation, anschließende Wirbelschichttrocknung, Tablettierung und Befilmung). Für die einzelnen Teilschritte ist ein spezielles Equipment erforderlich, das mehr oder weniger automatisiert ist. Doch können die Prozessschritte oft optimiert und reduziert werden.

Ferner sind große Pharmaunternehmen bestrebt, Abläufe und Technologien an den verschiedenen Standorten zu standardisieren und damit zu harmonisieren. Die Implementierung eines neuen Bildanalysesystems in mehreren Produktionsstätten ist ein Beispiel für eine solche Standardisierung. Mit Hilfe einer einheitlichen Prüfmethode zur Korngrößenbestimmung erhält man besser vergleichbare Ergebnisse bei der Charakterisierung von Wirk- und Hilfsstoffen.

Auch neue Technologien können dazu beitragen, Scale-up und Prozess-Übertragung zu beschleunigen. Besonders Erfolg versprechend sind kontinuierliche Verfahren, bei denen die Chargengröße allein über die Zeit variiert werden kann bei sonst konstanten Prozessparametern (z. B. Walzenkompaktierung, Extrusion sowie quasikontinuierliche Feuchtgranulation).

Der Einsatz der Process Analytical Technology (PAT) zur besseren Kontrolle von Herstellungsprozessen und schließlich zu deren Steuerung stellt eine neue Initiative dar, von der klassischen Produktvalidierung wegzukommen. Analytische Methoden, die hier Verwendung finden, nutzen beispielsweise NIR zur Online-Bestimmung der Mischungsgüte und zur Bestimmung der Produktfeuchte in Wirbelschichttrocknern.

Nach lebhaften Diskussionen wurde das nächste Symposium dieser Art auf den 10. Januar 2005 festgelegt.