Arzneistoffsynthese

U. Holzgrabe, A. Bechthold:Antibiotische Chemotherap

Bedenkt man, "... dass ein Teil dieser Farbstoffe extra synthetisch hergestellt worden ist und dass jedes der Präparate systematisch auf Toxizität an einer Reihe von Tieren erprobt und dann im Heilversuch geprüft werden muss, so wird man die ungeheure Menge Arbeit, die im Laufe der Jahre geleistet werden muss, abschätzen können". So beschrieb einst Paul Ehrlich den Aufwand zur Entwicklung wirksamer Medikamente gegen die Schlafkrankheit. Dieser Aufwand ist heute nicht geringer, im Gegenteil: Es müssen ca. 10 000 Substanzen synthetisiert und pharmakologisch getestet werden, ehe ein neuer Wirkstoff zur Marktreife kommt. Diese Zahl wiegt umso schwerer, als in den letzten Jahren ein Arsenal neuer Methoden zur Leitstruktursuche und - optimierung entwickelt worden ist. Neuerdings stellt man weniger die Leitstruktur in den Mittelpunkt der Forschung, sondern man sucht umgekehrt erst ein geeignetes Target, gegen das ein Medikament entwickelt wird. Dieser Ansatz, der mit dem Human Genome Project möglich geworden ist, wird mit dem Schlagwort "Genomics" charakterisiert.

Abgewandelte Azofarbstoffe als Chemotherapeutika

Paul Ehrlich kann nicht nur als der Begründer der Immunologie, sondern auch der rationalen Chemotherapie angesehen werden. Vor ihm wurde z. B. die Syphilis martialisch mit Quecksilber behandelt. Ehrlich ging hingegen systematisch zu Werke. Aus der Beobachtung, dass sich Zellen und Zellbestandteile mit Farbstoffen selektiv anfärben lassen, leitete er die Hypothese ab, dass sich die Infektionserreger durch Bindung geeigneter Substanzen (Farbstoffe) auch selektiv abtöten lassen müssten: "Corpora non agunt nisi fixata" schreibt er 1913 in Lancet [1]. So brachte die Verabreichung von Methylenblau bei Malariakranken eine Eindämmung des Fiebers. Ein Jahr später, 1892, setzten Breinl und Thomas Atoxyl® zur Behandlung der Schlafkrankheit ein.

Ehrlich klärte 15 Jahre später die Struktur auf: Die vermeintliche Arsanilsäure stellte sich als 4-Aminophenylarsonsäure heraus. Der Ersatz der N=N-Gruppe in den Azofarbstoffen durch Arsen, das sich in Form von giftigem Arsenik bei der Behandlung der Schlafkrankheit bewährt hatte, war einer der ersten Schritte zum rationalen Drug Design. Ehrlich beschritt diesen Weg weiter: Durch systematische Abwandlung des Atoxyl® wurde unter seiner Leitung das Arsphenamin synthetisiert; damit war Salvarsan®, das erste Chemotherapeutikum gegen Syphilis, gefunden. Ähnlich verlief die Entdeckung des Suramin: Ehrlich hatte mit Trypanosomen infizierte Mäuse durch eine Injektion mit Trypanrot heilen können. Strukturvariationen dieses Farbstoffs, insbesondere der Ersatz der Azogruppen durch Amidfunktionen, führten um 1920 zu Suramin, das bis heute gegen die Schlafkrankheit eingesetzt wird.

Azofarbstoffe fanden später Eingang in die Chemotherapie: 1932 beobachtete G. Domagk, dass das rote Sulfachrysoidin (Prontosil® rubrum) Streptokokken abtötet. Sulfachrysoidin würde man heute als Prodrug bezeichnen, das erst zu Sulfanilamid abgebaut werden muss, ehe es seine Wirkung entfalten kann. Diese Erkenntnis führte in den Dreißigerjahren zu einer Vielzahl von strukturell sehr ähnlichen Sulfonamiden. Vor 70 Jahren entdeckte Fleming rein zufällig das Penicillin. In schneller Folge wurden aus Mikroorganismen Gramicidin, Streptomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin isoliert, letztere alle aus Streptomyces-Arten, die später bei einer ganz anderen Methode wichtig werden sollten (siehe unten).

Vom Chinin zu den Chinolonen

Auf der Suche nach neuen Antibiotika wurden vor ca. 40 Jahren die Zwischenprodukte der Partialsynthese von Chloroquin (Resochin®), das sich von dem Naturstoff Chinin ableitet, auf ihre antimikrobielle Aktivität getestet. Dabei zeigte der 7-Chlor-4-hydroxychinolin- 3-carbonsäureethylester gute Wirksamkeit gegen Geflügelparasiten (Abb. 1).

Die Substanz wurde optimiert und kam 1962 als Nalidixinsäure (Nogram®) in den Handel. Da sie schlecht resorbiert wurde und ihre Wirksamkeit sich nicht auf ein breites Erregerspektrum erstreckte, konnte sie nur bei Harnwegsinfekten eingesetzt werden. 15 Jahre später wurde dieses Manko durch Einführung eines Piperazinringes in 7-Stellung des Grundgerüstes behoben. Die Pipemidsäure (Deblaston®) konnte wesentlich breiter als die Nalidixinsäure eingesetzt werden. Aber erst mit der Fluorsubstitution in 6-Position wurde die Substanzgruppe interessant. Damit hatte man eine neue Leitstruktur gefunden; die so genannten Fluorchinolone bewährten sich als Gyrasehemmstoffe. Ausgehend vom Norfloxacin (Barazan®) wurde eine Vielzahl von Substanzen in den Markt eingeführt.

QSAR-Analysen von Fluorchinolonen

Am Beispiel der 1-Phenyl-substituierten Fluorchinolone soll gezeigt werden, wie man eine solche neue Leitstruktur möglichst schnell in Bezug auf Pharmakodynamik und Pharmakokinetik optimieren kann. In den Fünfzigerjahren wurde von C. Hansch die Analyse "Quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen" (QSAR) [2] eingeführt. Hier wird versucht, die biologischen Aktivitäten von Substanzen mit physikochemischen Parametern zu korrelieren, d. h. die unterschiedlichen Aktivitäten verschieden substituierter Wirkstoffe mit den unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften der variierten Strukturelemente am Wirkstoff zu erklären. Dies sei an einem congeneren Satz von 4-Fluorchinolonen demonstriert, die am Benzolring in jeweils ortho-, meta- und para-Position Substituenten aufweisen, die sich in Bezug auf Lipophilie und elektronische Eigenschaften möglichst stark voneinander unterscheiden (Abb. 2).

Von allen Derivaten wurden minimale Hemmkonzentrationen (MIC) gegen verschiedene Bakterien sowie die 90-prozentige Hemmung der Gyrase aus E. coli (log 1/IC₉₀) bestimmt und nach Korrelationen mit den unterschiedlichsten physikochemischen Parametern wie elektronische Eigenschaften (pKa-Werte, σ), Lipophilie (logP, logk', R_m) und Größe (Sterimol-Parameter L, B1 und B5) gesucht [3].

Regressionsanalysen führten zu folgender signifikanten Korrelation:

log 1/MIC_{E. coli} = – 0,702(0,34)I_OH – 8,34(0,16)L + 8,58(0,54) (Zahl der Verbindungen n = 19; Regressions-Koeffizient r² = 0,64)

Aus der Gleichung ergibt sich eine negative Korrelation sowohl mit der Größe der Substituenten (L) als auch der Anwesenheit einer OHGruppe (I_OH); umgekehrt formuliert: Günstig sind kleine Substituenten sowie die Abwesenheit einer Phenolgruppe. Letzteres ist sicher mit Transportphänomenen in die Bakterienzelle zu erklären.

Die Korrelation mit der Hemmung des Enzyms, der Gyrase, sieht etwas anders aus:

log 1/IC₉₀ = 0,879(0,31)I_OH – 5,89(0,19) B5 – 1,32(0,54)R_m, + 0,67(0,64) (n = 16; r² = 0,78)

Wieder zeigt sich eine negative Korrelation mit der Substituentengröße (B5), zusätzlich ergibt sich eine negative Korrelation mit der Lipophilie (R_m) und diesmal eine positive Korrelation mit der Anwesenheit einer OH-Gruppe. Dazu ist zu bemerken, dass die 4-Hydroxyphenyl-substituierte Substanz im Enzymtest sich als das aktivste Chinolon erwies. Die Unterschiede zwischen Ganzzell- und zellfreien System lassen sich den unterschiedlichen Angriffspunkten der Chinolone, den Topoisomerasen II und IV, erklären [4]. Da die Proteinbindung ebenfalls mit der Bindung an relativ spezifische Proteine, zumeist Albumin, einhergeht, kann man das Ausmaß der Proteinbindung, bestimmt an Blutplasma mit Hilfe der Ultrafiltration, mit physikochemischen Paramtern korrelieren.

Auffällig ist auf den ersten Blick (Abb. 3), dass die Proteinbindung stark von den Substituenten in meta-Stellung am Benzolring abhängt. Die Variationen sind hier viel größer als bei den Substituenten in ortho- und para-Stellung. Deshalb wurden in der Regressionsanalyse nur diese Substanzen berücksichtigt.

% Bindung = – 0,64(0,03)B5 – 4,59(0,22) log(βB5 + 1) + 0,78(0,55) (n = 6; r² = 1,00)

In der bilinearen Korrelation ergibt sich ein Maximum der Proteinbindung bei einer bestimmten Größe der Substituenten (B5_opt = 2,05 ≈ methyl), d. h. größere oder kleinere Substituenten bewirken ein kleineres Ausmaß an Proteinbindung [5].

Fasst man nun beide QSAR-Analysen zusammen, so wundert es nicht, dass die Gyrasehemmstoffe der letzten Generation [6], die 1-Phenyl-substituierten Chinolone, am Benzolring in ortho- und para-Stellung ein Fluor aufweisen, das der kleinste Nicht-Wasserstoffsubstituent ist (z. B. bei Trovafloxacin). Auffällig bei allen neuen Gyrasehemmstoffen ist, dass es keinerlei Änderung der Leitstruktur gibt. Auch die 2-Pyridone, deren erster Vertreter, das ABT-719 [7], in der klinischen Prüfung ist, sind aus rein chemischer Sicht keine Innovation; sie können immer noch als vinyloge Amide aufgefasst werden!

Vom QSAR zum Molecular Modelling

Was kann man mit QSAR-Analysen erreichen?

Einerseits kann retrospektiv die biologische Aktivität innerhalb einer congeneren Substanzreihe mit physikochemischen Eigenschaften erklärt werden. Daraus können häufig Rückschlüsse auf das molekulare Aussehen der Bindungsstelle am Zielprotein gezogen werden.

Andererseits sind häufig Vorhersagen über die Wirksamkeit noch nicht synthetisierter Substanzen möglich. Dies kann entscheidend sowohl den Syntheseaufwand als auch die Zahl der pharmakologischen Testungen senken.

Es ist aber nicht möglich, mit QSAR zu neuen Leitstrukturen zu kommen, denn Extrapolationen außerhalb des Substanzsatzes sind nicht zulässig. Molecular-Modelling-Untersuchungen sind eher geeignet, um neue Leitstrukturen aufzufinden, wie kürzlich bei der Entwicklung neuer HIV-Protease- Hemmstoffe gezeigt wurde. Vor ca. zehn Jahren konnte man die 3D-Strukturen sowohl der HIV-Protease, eines Enzyms, das die bei der Virusvermehrung synthetisierten Polypeptide in funktionelle Proteine zerschneidet, als auch einiger Enzym-Inhibitor-Inhibitor- Komplexe bestimmen. Dabei wurde ein Minimalsubstrat, ein Heptapeptid (Ser-Leu-Asn-Phe-Pro-Ile-Val) identifiziert, das in der Folge durch systematische Strukturvariation erst am Computer und dann im Labor zu einem potenten Inhibitor der HIV-Protease optimiert wurde. Saquinavir ist das Produkt dieser erfolgreichen Bemühungen.

Molecular Modelling führt insbesondere dann sehr schnell zum Ziel, wenn man – wie eben gezeigt – die Zielstruktur eines Wirkstoffs gut kennt. So wundert es nicht, dass weitere HIVProtease-Hemmstoffe am Computer entworfen worden sind [8, 9]. Fehlt jedoch die Struktur des Target, was zumeist der Fall (siehe Fluorchinolone) ist, so ist das Auffinden neuer Leitstrukturen mit Hilfe des Computers schwierig.

Kombinatorik – Synthese "am Fließband"

Lange Jahre waren die Chemiker in der Lage, schneller zu synthetisieren, als die Pharmakologen die neuen Substanzen testen konnten. Mit der Einführung des High-Throughput-Screening (HTS) kehrten sich die Verhältnisse um. So musste man nach neuen Methoden zur schnellen Synthese vieler Substanzen suchen. Die Idee der Testphasenpeptidsynthese nach Merrifield [10] aufnehmend, wurde die Kombinatorik entwickelt [11], deren geistiger "Urvater" vielleicht Leibniz mit seiner Diplomarbeit "De Arte Combinatoria" gewesen ist. Sie wurde in den Anfängen als "Drug Discovery on the Assembly Line" gefeiert, als eine Revolution, die der Einführung des Fließbandes in der Automobilproduktion durch Henry Ford gleichkommt [12, 13].

Repräsentativ für viele verschiedene, aber prinzipiell ähnliche Techniken sei hier die Split-and-Pool-Methode vorgestellt. Abbildung 4 zeigt, wie drei verschiedene Substanzen an eine polymere feste Phase gekoppelt und auf drei Töpfe aufgeteilt werden (split). Im nächsten Schritt wird mit drei Partnern umgesetzt, sodass neun Produkte entstehen, die ebenfalls auf die drei Töpfe gleichmäßig verteilt werden. Im letzten Schritt dieses Beispiels wird nochmals mit drei Reaktanten umgesetzt. Auf diese Weise werden nach dem one-bead-one-compound-Konzept in neun Reaktionsschritten 27 verschiedene Produkte hergestellt. Dafür hätte man in der klassischen Synthese 81 Reaktionen benötigt.

Dieses Prinzip ist z. B. auf die parallele Synthese von Chinolonderivaten angewendet worden [14]: Dreifach Fluor-substituierte Benzoylessigsäure wurde an ein Wang-Harz gebunden, nach Knoevenagel mit Dimethylformamiddimethylacetal und drei verschiedenen primären Aminen zu Enaminen umgesetzt und zyklisiert. Durch nukleophile Substitution des Fluoratoms am C2 gegen vier verschiedene zyklische Amine erhielt man 36 Gyrasehemmstoffe, die im letzten Schritt noch von dem Harz abgespalten werden mussten (Abb. 5). Ob darunter außer dem bereits bekannten Ciprofloxacin wirksame Derivate waren, ist nicht bekannt.

Bis jetzt wenig Resultate

Nach der Kombinatorischen Synthese folgt das Screening der Substanzgemische, die sich in den Töpfen befinden. Zeigt sich eine pharmakologische Wirkung, muss der "Hit" aus dem Topf herausgefischt werden. Dieser Prozess, die Dekonvolution, ist recht aufwendig. So wundert es nicht, dass heute häufig eine Methode genutzt wird, bei der in jedem Töpfchen nur eine Substanz synthetisiert wird, die darauf dem HTS zugeführt wird. Damit kann man eigentlich nicht mehr von Kombinatorik reden, sondern nur noch von Robotik [15].

Trotz des unbestrittenen Vorteils der Erzeugung großer Substanzmengen muss die Kombinatorik bzw. Robotik noch den Beweis antreten, dass man mit ihrer Hilfe effizient neue Leitstrukturen finden kann. Der erwartete Boom an neuen Leitsubstanzen ist bisher ausgeblieben. Dafür wird die Kombinatorik umso häufiger bei der Optimierung von Leitstrukturen, d. h. der systematischen Strukturvariationen, eingesetzt.

Antibiotika und Chemotherapeutika aus der Natur

Artemisinin In den "Rezepten für den Notfall" (China, 340 n. Chr.) heißt es: "Man nehme eine Handvoll qing hao, weiche sie in einem shang (ca. 1l) Wasser ein, siebe die Flüssigkeit und trinke sie, um das Fieber zu unterdrücken." Heute wissen wir, dass dieser Extrakt aus Artemisia annua, der bei Malaria eingesetzt wurde, als wirksames Prinzip Artemisinin (= qinghaosu, Abb. 6) enthält, das sehr stark gegen Blutschizonten wirkt (IC₅₀ ∼ 0,6 bis 6 µg/ml) [16]. Das Sesquiterpenlacton Artemisinin weist aufgrund schlechter Wasserlöslichkeit und unvollständiger Resorption eine schlechte Bioverfügbarkeit auf.

In vivo wird es schnell zu dem Halbketal Dihydroartemisinin umgesetzt, das besser bioverfügbar und stärker wirksam ist. Da dieses Halbketal im sauren Medium des Magens chemisch instabil ist, wurde eine Vielzahl von Derivaten des Halbketals hergestellt, von denen Artemether (Paluther®) inzwischen im Handel ist (Abb. 6). Verschiedene Ester sind in der klinischen Prüfung. Interessanterweise ist der Wirkmechanismus dieser Substanzgruppe bis heute nicht endgültig geklärt [17].

Taxoide und Epothilone Die Suche nach neuen Wirkstoffen in Pflanzen und Mikroorganismen ist bis heute aktuell. So hat Paclitaxel aus Taxus brevifolia, ein Hemmstoff der Tubulinpolymerisation, in den letzten Jahren Furore gemacht; diese sehr stark wirksame Substanz ist nur in kleinsten Mengen in der Pazifischen Eibe zu finden. Seit man das Problem der Partialsynthese gelöst hat [18], sind Paclitaxel (Taxol®) und das Derivat Docetaxel (Taxotere®) im Handel. Die Optimierung der Substanz geht weiter: Ojima stellte 1998 die zweite Generation der Taxoide vor, fluorierte Derivate, die eine höhere Zytotoxizität bei langsamerer Metabolisierung zeigen [19].

Epothilon A und B wurden aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum isoliert [20]. Sie haben den gleichen Wirkmechanismus wie Taxol, zeichnen sich aber durch bessere Wasserlöslichkeit und stärkere Wirksamkeit gegen Multiple-drug-resistence-Zelllinien aus und sind somit interessante Kandidaten für die klinische Prüfung.

Topotecan Auch Camptothecin aus Camptotheca acuminata, ein Hemmstoff der Topoisomerase I [21], wurde chemisch verändert. In der Zytostatikatherapiet werden Topotecan (Hycamtin®) und Irinotecan (Campto®) bereits routinemäßig eingesetzt, weitere Derivate [22] sind in der klinischen Prüfung [23].

Zyklische Endiine Auch zyklische Endiine, wie Esperamycin aus Actinomadura verrucosospora, Calcheamycine aus Micromonospora echinospora und Dynemicin aus Micromonospora chersina, werden auf ihre klinische Anwendbarkeit getestet. Vielleicht noch Zukunftsmusik ist Leinamycin, das 1989 aus Streptomyces-Arten isoliert wurde [24]. Es wandelt O₂ zu O₂-Radikalen um, die die DNA zerstören [25], bzw. alkyliert die DNA über einen komplexen Mechanismus [26].

Wirkstoffe aus dem Meer

Bisher wenig untersucht sind die Inhaltsstoffe von marinen Organismen, wie z.B. Schwämmen. Hier wurden kürzlich Makrolide isoliert, wie Spongistatin aus Spirastrella spinispirulifera, Cinachyrolid A aus Cinachyra sp. oder Altohyrtine aus Hyrtios altum. Diese zu den Spongistatinen zählenden Substanzen sind hoch potente Mitosehemmstoffe und damit ernst zu nehmende Kandidaten für die Chemotherapie [27]. Aber auch lange bekannte Naturstoffe, wie z. B. die peptidischen Lantibiotika Nisin und Mersacidin [28, 29], oder Microcine [30] können – nach Aufklärung des Wirkmechanismus – zu interessanten Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika werden. Diese wenigen ausgewählten Beipiele zeigen schon sehr eindrucksvoll, dass in der Natur ein hohes Maß an Biodiversität zu finden ist [31].

Synthasegene – Schlüssel der Biosynthese

Zu Beginn der Achtzigerjahre [34 – 36] konnte in mehreren unabhängig voneinander durchgeführten Arbeiten gezeigt werden, dass die Gene, die für die Biosynthese eines von einem Streptomyceten gebildeten Naturstoffes verantwortlich sind, auf dem Genom als Cluster vorliegen. Es wurden Verfahren entwickelt, die die Klonierung dieser DNA-Abschnitte ermöglichen.

Besonders intensiv wurde über die Biosynthese von Substanzen gearbeitet, die zu den Polyketiden gehören. Diese werden durch Polyketidsynthasen gebildet, die die Verknüpfung von Acyl-CoA-Einheiten zu verschiedenartigen Ringsystemen katalysieren. Die Biosynthese erfolgt in mehreren Schritten (Abb. 7):

Sie wird initiiert durch Anlagerung eines Acyl-Restes (Starter-Einheit), der als CoA-Ester in der Zelle vorkommt, an die Ketosynthasekomponente der Polyketidsynthase.

Eine "Extender-Einheit", ebenfalls ein CoAEster, wird darauf an die Phosphopantotheinylgruppe der Acyl-Carrier-Komponente gebunden.

Anschließend erfolgt die Kondensation beider Einheiten unter Decarboxylierung.

Diese nun verlängerte Kette kann während der Biosynthese durch Reduktasen, Dehydratasen und Enoylreduktasen verändert werden, bevor sie in einem weiteren Zyklus weiter verlängert wird [37]. Polyketidsynthasegene wurden in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen gefunden. Sie lassen sich aufgrund ihrer Struktur in drei Gruppen einteilen.

Bei der ersten Gruppe, die in Eukaryonten und außerdem bisher in einem Streptomyces-Stamm gefunden wurde, handelt es sich um große, multifunktionale Enzyme, die den Aufbau der Polyketidgrundstrukturen katalysieren. Dabei wird eine "iterative" Funktionsweise angenommen: Jedes katalytische Zentrum des Enzyms agiert mehrmals an der wachsenden Polyketidkette. Sehr gut untersucht ist eine Methylsalicylsäure-Synthase aus Penicillium patulum, die die Bildung von Methylsalicylsäure aus Acetyl-CoA-Einheiten katalysiert [38]. Das Enzym besitzt verschiedene katalytische Zentren (ACP, KS, AT, DH, KR), die alle nötigen Schritte der Biosynthese durchführen.

Die modularen Polyketidsynthasen (Typ-IPolyketidsynthasen) wurden in Prokaryonten gefunden, beispielsweise die Polyketidsynthase in Saccharopolyspora erythraea, die die Biosynthese des Erythromycin- Aglykons katalysiert [37]. Sie besteht aus drei Untereinheiten, die jeweils aus zwei Modulen aufgebaut sind. Jedes Modul enthält katalytische Zentren für Acyltransferase (AT), Acyl-Carrier-Protein (ACP), Ketosynthase (KS), Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER) und Thioesterase (TE), die für die Ausbildung der spezifischen Grundstruktur des Polyketides verantwortlich sind. Jedes Modul katalysiert die Biosynthese eines bestimmten Abschnittes des Polyketides.

Die iterativen Polyketidsynthasen (Typ-IIPolyketidsynthasen), die ebenfalls in Prokaryonten gefunden wurden, bestehen aus vielen einzelnen Enzymen mit je einer spezifischen katalytischen Aktivität. Wie bei den Polyketidsynthasen der Eukaryonten agiert jedes dieser katalytischen Zentren mehrmals an der wachsenden Polyketidkette. Besonders gut untersucht sind die Typ-II-Polyketidsynthasen aus Streptomyces glaucescens (Tetracenomycin-Produzent) und aus Streptomyces coelicolor (Actinorhodin-Produzent). Drei Enzyme, nämlich eine Ketosynthase, ein Kettenlängenfaktor und ein Acyl-Carrier-Protein, bilden die minimale Einheit, die den Aufbau der Polyketidkette katalysiert.

Ketoreduktasen, Zyklasen und andere Enzyme katalysieren letztendlich die Synthese des zyklisierten und modifizierten Polyketides [37 –41].

Kombinatorische Biosynthese

Experimente zur "Kombinatorischen Biosynthese" wurden zunächst mit iterativen Polyketidsynthasen durchgeführt. Durch Transformation der entsprechenden Gencluster eines Organismus in einen anderen wurden Gene recht ungezielt miteinander kombiniert. Zwar wurden neue Verbindungen erhalten, es überrascht jedoch nicht, dass sich diese nur geringfügig von den Ausgangsverbindungen unterschieden [42]. Da diese ungezielte Kombination von Genen nicht zu den erhofften Ergebnissen geführt hatte, wurde ein System geschaffen, in dem zunächst der Actinorhodin-Produzent, Streptomyces coelicolor CH999, durch Deletion des gesamten Biosynthesegenclusters so verändert wurde, dass er kein Antibiotikum mehr produzierte. Als zweite Komponente des Systems wurde das Plasmid pRM5 konstruiert, das unter anderem das Gen actII-ORF4 enthielt, das für einen Transkriptionsaktivator codiert. Dieser reguliert die Transkriptions-Aktivität des Promotors P_actI und so die Expression der in das Plasmid hinter den Promotor eingefügten Gene [43].

Polyketidsynthasegene aus Stämmen, die verschiedene Antibiotika herstellen, wurden im Plasmid pRM5 unterschiedlich miteinander kombiniert und im Rezipientenstamm exprimiert. Je nach Auswahl und Anordnung der Gene auf dem Plasmid wurden unterschiedliche Verbindungen produziert, deren Strukturen sich zum Teil stark von der des Actinorhodins und der anderen Ausgangsverbindungen unterschieden [44 –50] (Abb. 8).

Diese Erfolge ermutigten Wissenschaftler, auch die Gene der modularen Polyketidsynthasen zur Herstellung neuer Verbindungen heranzuziehen. Besonders intensiv wurde eine Polyketidsynthase (DEBS) aus Saccharopolyspora erythraea untersucht, die die Biosynthese von 6-Deoxyerythronolid B (6-dEB), Grundbaustein des Erythromycins, katalysiert.

DEBS besteht aus drei großen Enzymen (EryAI, EryAII, EryAIII), alle mit einer Molekularmasse > 300 kD. Nachdem die Coexpression von eryAI, eryAII und eryAIII in Streptomyces coelicolor CH999 gelang und die Bildung von 6-dEB nachgewiesen worden war, wurden anschließend Mutationen in die Gene eingefügt, durch die einzelne katalytische Zentren ausgeschaltet wurden.

Die Expression dieser mutierten Gene führte zur Bildung der erwarteten Keto- und Anhydroderivate von 6-dEB [51] (Abb. 9). Die Bildung eines zwölfgliedrigen Makrolactonringes statt eines vierzehngliedrigen gelang durch die Expression von eryAI, eryAII und eines chimären Gens, bestehend aus KS, AT und KR des Moduls 5 und ACP und TE des Moduls 6 aus eryAIII [52] (Abb. 9). Bis heute sind auch hier mehr als 50 neue Substanzen gebildet worden. Einige dieser Substanzen sollen ganz neue pharmakologische Eigenschaften aufweisen [53].

Kombination unterschiedlicher Biosynthesewege

Bisher noch wenig untersucht wurde, wie weit man mit Hilfe der "Kombinatorischen Biosynthese" Moleküle herstellen kann, deren Einzelbestandteile über unterschiedliche Biosynthesewege gebildet werden (Zucker-Polyketide; Zucker-Polypeptide; Fettsäuren-Polyketide; Isopreneinheiten-Polyketide etc.). Ein bereits 1995 durchgeführtes Experiment zeigt, dass dies prinzipiell möglich ist. Ein etwa 25 000 Basenpaare großes DNA-Fragment von Streptomyces olivaceus (Cosmid 16F4), auf dem Gene des Elloramycin-Biosynthese-Genclusters lokalisiert waren, wurde in Streptomyces fradiae, dem Urdamycin-Produzenten, zur Expression gebracht. Eine von dem transformierten Streptomyces-Stamm gebildete Substanz, 8-D-Olivosyl-8-demethyl-tetracenomycin C, enthielt Strukturmerkmale, die sowohl im Urdamycin als auch im Elloramycin vorkommen [54] (Abb. 10).

Derzeit noch nicht publizierte Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein auf dem DNA-Fragment lokalisiertes Glykosyltransferasegen für die Bildung der neuen Substanz verantwortlich ist. Die Erzeugung neuer Substanzen mit Hilfe der "Kombinatorischen Biosynthese" gelingt heute auch mit Genen, die an der Biosynthese von Peptidantibiotika beteiligt sind. Weitere Substanzgruppen (Oligosaccharidantibiotika, Aminoglykosidantibiotika) werden intensiv bearbeitet.

Somit kann resümiert werden, dass sich mit Hilfe der kombinatorischen Biochemie ein hohes Maß an Diversität erzeugen lässt, was das Auffinden von ganz neuartigen Leitstrukturen ermöglicht [55]. Außerdem bietet sie die Chance, Naturstoffe von Mikroorganismen zu exprimieren, die nicht biotechnologisch kultiviert werden können, und das sind etwa 95% der Mikroben. Daraus ergibt sich das ungeheure Potenzial der kombinatorischen Biochemie [56].

Genomics

Die Entwicklung von Resistenzen gegen Antibiotika ist ein immer größer werdendes Problem. Deshalb ist es wichtig, nicht nur immer spezifischere und selektivere Reagenzien gegen bekannte Targets zu entwickeln, sondern auch nach neuen Targets zu suchen [57].

Bisher hat man bei der Entwicklung neuer Antibiotika häufig zuerst eine neue Substanz in der Hand, deren Wirkmechanismus man aufgeklärt hat, um dann weitere potentere Derivate zu entwickeln. Heute versucht man diese bottom-up-Philosophie umzukehren, d. h. top-down erst ein Target zu definieren, das man dann mit spezifischen Substanzen zu antagonisieren versucht. D.T.W. Chu formulierte dies so [58]: "The only certain way to avoid encountering previously generated resistance is to seek new targets against which antagonists have not been previously generated."

Dieser Weg ist möglich geworden, da man heute in der Lage ist, ganze Genome von Mikroorganismen zu sequenzieren [59, 60]. Abbildung 11 skizziert das weitere Vorgehen: In einem bekannten Genom muss ein Gen identifiziert werden, das es möglichst in allen Bakterien, aber auch nur in Bakterien gibt. Um herauszufinden, ob das Gen für das Bakterium essenziell ist, wird es z. B. durch homologe Rekombination mit externen Genen (Drug resistance marker) unterbrochen. Ist dann das Bakterium nicht mehr lebensfähig, kann das Gen als essenziell angesehen werden. Es wird kloniert, um viel Protein aus dem Gen zu produzieren und einen Assay für einen Inhibitor entwickeln zu können. Hat man einen solchen gefunden, kann man ihn optimieren, sodass man am Ende einen neuen Wirkstoff gegen ein neues Target besitzt. Ohne auf Details einzugehen, dürfte klar sein, dass dieser Weg zwar sehr innovativ, aber nicht ganz einfach und sehr zeitaufwendig ist. Trotz allem gibt es eine Reihe von Pharmafirmen, die ihn beschreiten [61].

Mit besseren Methoden in die Zukunft

Seit Paul Ehrlich hat man eine Reihe von ausgefeilten Techniken entwickelt, die die schnelle Optimierung von bereits gefundenen Leitstrukturen ermöglichen. über die kombinatorische Biochemie bis zum Genomics-Ansatz. Auch ist es nicht unwichtig, dem Kollegen Zufall, dem wir so viele neue Antibiotika zu verdanken haben – man denke nur an das Penicillin [63] –, eine gute Chance zu geben. So kann man nicht unbedingt von einem Paradigmenwechsel der Arzneistofffindung sprechen, sondern viel mehr von der Erweiterung des Methodenspektrums zur Entdeckung neuer Leitstrukturen und zur Wirkstoffoptimierung.

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In den letzten Jahren sind zahlreiche neue Methoden entwickelt worden, um die Leitstrukturen neuer chemisch definierter Wirkstoffe – egal, ob natürlichen oder synthetischen Ursprungs – aufzufinden und zu optimieren. Ein anderes Prinzip der modernen Arzneistoffentwicklung besteht darin, zuerst eine für den pathologischen Prozess relevante Struktur, z.B. ein Protein oder das dafür codierende Gen, aufzuspüren und dann eine darauf einwirkende Substanz zu entwickeln. Diese Techniken sind unter den Begriffen Genomik und Proteomik bekannt geworden. Besonders erfolgversprechend ist die moderne Arzneistoffentwicklung auf dem Gebiet der Antibiotika, wo sie die Herausforderung angenommen hat, der zunehmenden Resistenz der Mikroben mit neuen Wirkstoffen zu begegnen.

DAZ 2000, Nr. 8, S. 43, 20.02.2000

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