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Technologie
H. ReinNIR-Vis-Spektroskopie – ein modernes An
Atomschwingungen und NIR
Der Bereich des nahen Infrarotlichtes (NIR) erstreckt sich vom Ende des sichtbaren Lichtes (Vis) bei etwa 780 nm bis zu einer Wellenlänge von 2500 nm. In diesem Teil des Spektrums finden sich vor allem die Obertöne oder Kombinationen von Streckgrundschwingungen von Elektronenbindungen der Elemente Phosphor, Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Da der molare Extinktionskoeffizient dieser Bindungen klein ist, ist auch mit einer relativ hohen Nachweisgrenze für eine Verbindung zu rechnen. Folglich ist die NIR-Spektroskopie in den meisten Fällen nicht für eine Spurenanalyse geeignet. Dagegen ist sie hervorragend geeignet, eine Vielzahl pharmazeutisch genutzter Hilfs- und Wirkstoffe direkt und ohne vorhergehende Probenvorbereitung zu analysieren.
Spektrometer und Spektren
Prinzipiell lassen sich NIR-Spektren als Reflexions- oder Transmissionsspektren aufzeichnen. Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau eines NIR-Spektrometers, welches sowohl mit einer Küvette für die Untersuchung von Flüssigkeiten als auch mit einer flexiblen Glasfaseroptik ausgestattet ist. Diese bietet z. B. die Möglichkeit, Messungen in sterilen oder explosionsgefährdeten Bereichen eines Betriebes durchzuführen, da sich das eigentliche Messgerät auch weit entfernt von der Messstelle aufstellen lässt.
Auswertung der Spektren
Die Tatsache, dass viele physikochemische Eigenschaften, wie z. B. Partikelgröße oder Kristallinität, Einfluss auf die Spektrenform einer Probe haben, galt lange Zeit als Nachteil. Langsam setzt sich jedoch die Erkenntnis durch, dass gerade auch darin ein großer Vorteil der Methode liegt, da sich diese Eigenschaften sozusagen als Nebenprodukt mitbestimmen lassen.
Abbildung 2 zeigt die typischen NIR-Spektren diverser Stärken. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit und des Überlappens der vergleichsweise breiten Absorptionsbanden galten solche Spektren lange Zeit als nicht auswertbar. Früher sind hierfür mathematische Modelle zur Datenreduktion notwendig gewesen, um mit der Kapazität der zur Verfügung stehenden Rechner eine Auswertung in hinreichend kurzer Zeit durchführen zu können. Das Misstrauen gegenüber diesem als "Hauptkomponentenanalyse" bezeichneten Rechenverfahren liegt u. a. darin begründet, dass sie den direkten Zusammenhang zwischen gemessener Eigenschaft und Spektrum herstellen aber auch verschleiern kann. Bei den heute verwendeten Rechnern steht die Datenreduktion nicht mehr im Vordergrund.
Aufgrund von zahlreichen Überlagerungseffekten ist die in den Spektren enthaltene Information nicht nur, wie z. B. bei UV-Vis-Spektren, in den Extinktionswerten bei definierter Wellenlänge enthalten, sondern auch und vor allem in der Spektrenform. Folglich ist es nicht möglich, Gehalte oder Identitäten bei definierter Wellenlänge zu bestimmen. Auch ist nicht bekannt, welche Spektrenform welcher Eigenschaft entspricht. Das heißt, dass es in der NIR-Vis-Spektrometrie immer notwendig ist, die aus den Spektren gewonnenen Daten mit den Ergebnissen konventioneller Analysenverfahren zur Identitäts- oder Gehaltsbestimmung zu korrelieren.
Da man nie genau weiß, ob das erstellte mathematische Modell auch wirklich auf dem Zusammenhang zwischen gesuchter bzw. zu bestimmender Eigenschaft und gemessenen Spektraldaten beruht oder ob man es eventuell mit einer Nonsenskorrelation zu tun hat, ist bei jeder neuen Fragestellung oder neu hinzukommenden Substanz die Funktionsfähigkeit des verwendeten Modells zu überprüfen. Auch ist leicht einzusehen, dass die Ergebnisse der NIR-Vis-Analytik nicht genauer sein können als die mit der jeweiligen Referenzmethode gewonnenen Daten.
Modell der Hauptkomponentenanalyse
Wie kann man aber nun den aussagekräftigen Teil der Spektren vom überflüssigen Ballast trennen? Der erste Schritt besteht darin, dass man sich ein solches Spektrum nicht mehr als Kurve in einem Koordinatenkreuz vorstellt. Ein Spektrum besteht ja aus einer gewissen Anzahl von Messpunkten, die dadurch entstehen, dass man in vorgegebenen Wellenlängenabständen die jeweilige Reflexion misst. Üblicherweise stellt man jeder Wellenlänge den gemessenen Reflexionswert in einem Koordinatensystem - mit den Achsen Reflexion und Wellenlänge - gegenüber und gelangt so zu den vertrauten Spektren.
Die Hauptkomponentenanalyse geht hier aber einen anderen Weg: 1. Alle gemessenen Reflexionsdaten werden in einer Reihe nebeneinander geschrieben (vektorielle Darstellung). In der vektoriellen Darstellung in einem n-dimensionalen Raum (n = Anzahl der für ein Spektrum bestimmten Reflexionswerte) entspricht folglich jedes Spektrum nur einem Punkt. Wird nun für jede durchgeführte Messung genau der gleiche Messzyklus verwendet, erhält man folglich auch für jede Messung die gleiche Anzahl an Messwerten. Die Daten jeder Messung können nun in einer Tabelle untereinander geschrieben werden, in jeder Zeile ein "Spektrum", in jeder Spalte der Reflexionswert für eine bestimmte Wellenlänge.
2. Da der Betrag der gemessenen Reflexion von mehreren Dingen abhängig ist, z. B. von der Partikelgröße der untersuchten Substanz, kann man die Daten nicht ohne vorhergehende Normierung verwenden. Man bildet dabei für jede Spalte den Mittelwert. Alle Mittelwerte zusammen ergeben das Mittelwertspektrum. Dieses entspricht im Vektorraum dem Volumenschwerpunkt, der nun als Nullpunkt des n-dimensionalen Raumes definiert wird.
3. Das Mittelwertspektrum wird von jedem Spektrum subtrahiert, indem man den jeweiligen Mittelwert einer Spalte von dem entsprechenden gemessenen Reflexionswert abzieht. Im Vektorraum erreicht man dadurch eine Zentrierung der Spektren um den Volumenschwerpunkt.
4. Von den neuen, zentrierten Reflexionswerten wird in jeder Spalte die Standardabweichung bestimmt. Nur Spalten, in denen man für die zentrierten Reflexionswerte hinreichend große Standardabweichungen erhält, erhalten Daten, die zur Unterscheidung oder quantitativen Auswertung nach Korrelation geeignet sind. Unterschreiten die Werte ein gewisses Maß an Variabilität (sichtbar an einer kleinen Standardabweichung), sind die betreffenden Reflexionsdaten nicht mehr zur Auswertung brauchbar. Unterschiede sind dann entweder zu klein, um auf diese Weise fassbar zu sein, oder beruhen auf dem Grundrauschen der Messeinrichtung. Im Allgemeinen reichen 15 Spalten, die nun als Faktoren bezeichnet werden, mit der höchsten Variabilität aus, um eine Substanz eindeutig zu charakterisieren.
5. Soll eine quantitative Auswertung der Spektren erfolgen, muss man nach dem Faktor suchen, dessen Werte am besten mit den Ergebnissen der Referenzmethode korrelieren. Dies kann auch ein Faktor mit einer höheren Zahl als 15 sein.
Anwendungsbeispiel
Das beschriebene Verfahren soll anhand eines vereinfachten Beispieles erläutert werden. Von drei verschiedenen Proben wurden "NIR-Vis-Spektren" bei jeweils sechs Wellenlängen l1 bis l6 aufgenommen. In der vektoriellen Schreibweise ergibt sich die folgende Darstellung mit der Berechnung des Mittelwertspektrums:
Das berechnete Mittelwertspektrum wird nun zur Zentrierung der Spektren von jedem Spektrum subtrahiert. Damit wird der Mittelwert jeder Spalte gleich Null, und man erhält:
Die zentrierten Spektren werden nun auf ihre Variabilität hin untersucht. Von jeder Spalte wird z. B. die Standardabweichung ermittelt, um so die wichtigen "Faktoren" ermitteln zu können. Diese werden dann nach ihrer Aussagekraft neu geordnet:
An dieser Stelle der Auswertung kann es notwendig sein, die berechneten Werte nach bestimmten Regeln zu vergrößern oder zu verkleinern. Der Grund hierfür ist, dass man bestimmte Eigenschaften der untersuchten Substanzen, die nur geringe Veränderungen im Spektrum hervorrufen und sich daher auch erst in höheren Faktoren bemerkbar machen, hervorheben möchte. Diese Anpassung führt in der Regel dazu, dass alle selektionierten Faktoren im Mittel gleich groß sind.
Das Ergebnis lässt sich graphisch als Dreifaktorplot darstellen. Verwendet man nur zwei Faktoren, erhält man den entsprechenden Zweifaktorplot. Umgekehrt lässt sich aus einer genügend großen Anzahl an Faktoren jedes Spektrum bis auf eine Restabweichung, das Residuum, rekonstruieren. Vermisst man dieselbe Probe mehrmals hintereinander, erhält man aufgrund der Streuung der Messwerte statt eines Punktes eine Wolke im entsprechenden Raum.
Quantitative Auswertung
Bei der quantitativen Auswertung werden nun einzelne Faktoren mit den Ergebnissen der Referenzmethode korreliert. Die Modellspektren seien bei der Untersuchung verschiedener Lebensmitteln entstanden. Mittels der Stickstoffanalyse nach Kjeldahl ergaben sich in den drei Proben folgende Eiweißanteile:
Im gezeigten Beispiel korreliert der Eiweißgehalt am besten mit dem Faktor 3. Der Fall, dass die gesuchte Eigenschaft nur von einem Faktor abhängt, kommt in der Praxis selten vor. Meistens zeigen mehrere Faktoren eine Abhängigkeit von der zu bestimmenden Größe. Korrelieren z. B. zwei Faktoren mit der gesuchten Eigenschaft, erhält man in einem dreidimensionalen Raum anstelle der Ausgleichsgeraden eine Ausgleichsebene.
Man muss bei der quantitativen Auswertung grundsätzlich beachten, dass der schlüssige Zusammenhang zwischen Faktor und gesuchter Eigenschaft nur statistisch abgesichert werden kann. Daher folgt auf jede Entwicklung eines Auswertemodells, das auf einem Kalibrier- oder Lerndatensatz basiert, auch die Überprüfung anhand eines Testdatensatzes mit bekannten Eigenschaften.
Pharmazeutische Anwendungen
Im Europäischen Arzneibuch ist die NIR-Vis-Spektroskopie im Kapitel 2.2.40 des Allgemeinen Teiles enthalten. Allerdings existiert z. Z. keine Stoffmonographie, in der die NIR-Spektroskopie zur Identitäts-, Reinheits- oder Gehaltsprüfung vorgeschrieben wird. Trotzdem bietet diese Art der Spektroskopie ein erhebliches Potenzial, sowohl hinsichtlich der Personal- und Zeiteinsparung im Qualitätssicherungsbereich als auch in der Erfassung von bisher nur sehr schwer zugänglichen Prozessdaten. Dies soll anhand einiger Beispiele kurz aufgezeigt werden.
Identifikation von Substanzen
Die Substanzidentifizierung ist das klassische Einsatzgebiet der NIR-Vis-Spektroskopie. Es müssen nicht mehr aufwändig Proben der benötigten Rohstoffen gezogen werden, um diese dann von der Qualitätskontrolle überprüfen zu lassen. Befinden sich die Substanzen in Gebinden, die im NIR-Bereich durchsichtig sind, können sie direkt bei Anlieferung, ohne dass die Verpackung geöffnet wird, auf Identität oder auch auf den geforderten Gehalt hin untersucht werden. Dasselbe gilt für zahlreiche Arzneimittel, z. B. Tabletten, die in intakten Blisterpackungen überprüft werden können.
Beispiel Stärke
Wie genau diese Methode arbeitet, soll hier anhand der Identifizierung verschiedener Polysaccharide und Stärken gezeigt werden [1]. Mittels Hauptkomponentenanalyse lassen sich die in Abbildung 2 gezeigten Spektren in einen Dreifaktorplot (Abb. 3) überführen. Aus den kaum zu unterscheidenden Spektren ist ein Modell entstanden, das zur Unterscheidung der einzelnen Polysaccharide geeignet ist. Deutlich sind die verschiedenen Substanzen voneinander getrennt, während die drei untersuchten Tapiokastärken eine gemeinsame "Messwolke" bilden.
Sollen auch die Tapiokastärken noch weiter unterschieden werden, ist das Modell weiter zu verfeinern. Abbildung 4 zeigt die Auftrennung der untersuchten Tapiokastärken im Dreifaktorplot. Die Lage auf der x-Achse korreliert dabei mit dem Amylosegehalt der Proben. Bemerkenswert ist, dass sich die etwas abseits befindliche Tapiokastärke "Brasilien" von den drei anderen Stärken auch hinsichtlich ihres physikochemischen Verhaltens (Verkleisterungs- und Retrogradationsverhalten, Amylosegehalt) deutlich unterscheidet.
Das entwickelte Modell arbeitete so gut, dass sogar die Stärke-Handelspräparate einzelner Hersteller identifizierbar waren, auch wenn diese Produkte aus unterschiedlichen Herstellungsjahren stammten (mittels Chargennummern nachweisbar). Ob die detektierten Unterschiede innerhalb einer Stärkesorte auf den Isolierungsprozess, die angebaute Pflanzensorte oder die Anbaubedingungen zurückzuführen sind, wurde nicht weiter untersucht.
Gehaltsbestimmungen
Neben der Identifikation von Substanzen stellen die Gehaltsbestimmungen zurzeit das zweite große Einsatzgebiet der NIR-Vis-Spektroskopie dar. Von Vorteil ist, dass mehrere Inhaltsstoffe parallel bestimmbar sind, wodurch eine erhebliche Einsparung an Analysenzeit möglich wird.
Ausgehend von den in Abbildung 2 gezeigten Spektren, können Amylose- und Wassergehalt der untersuchten Polysaccharide ermittelt werden [2]. Die Referenzmethode zur Wassergehaltsbestimmung ist die Thermogravimetrie (Abb. 5), bei der der Masseverlust bei zunehmender Temperatur aufgezeichnet wird.
Die Referenzmethode zur Amylosegehaltsbestimmung ist die photometrische Titration mit 0,001 n Iodlösung (Abb. 6). Dabei wird die Extinktion einer gelösten Stärkeprobe mit und ohne Amylosestandard bei einer Wellenlänge von l = 625 und steigender Iodkonzentration registriert. Der Amylosegehalt der Probe lässt sich dann aus dem zugesetzten Amylosestandard und der Extiktionsdifferenz (Probe + Standard) zur Probe errechnen [2]. Diese Analytik ist sehr aufwändig: Für die Bestimmung von Wasser- und Amylosegehalt einer Probe benötigt man etwa einen Tag.
Aufgrund der mit diesen Methoden gewonnenen Daten wurde ein Modell entwickelt, das neben der Identifizierung der Stärke in einem Zweistufenprozess den Wassergehalt und den Amylosegehalt erkennen konnte. Messung und Auswertung sind nun innerhalb einer Minute möglich. Die Korrelation der selektionierten Faktoren mit Wasser- bzw. Amylosegehalt ist in Abbildung 7 dargestellt.
Online-Überwachung bei der Granulierung
Die Prozessdatenüberwachung von Partikelgröße und Wassergehalt bei der Wirbelschichtgranulierung stellt aufgrund der bisher anwendbaren, langsamen Analysenverfahren ein großes Problem dar. Wenn die ersten Daten über den Wassergehalt des zu produzierenden Granulates vorliegen, ist der Granulierungsprozess schon lange beendet. Auch hier kann die NIR-Vis-Spektroskopie zur Problemlösung beitragen [3].
Die Bestimmung des Wassergehaltes stellt zunächst keine entscheidende Neuerung dar. Interessant ist an dieser Stelle vielmehr, wieso eine Online-Bestimmung der Korngröße möglich ist. Um dies zu verstehen, reicht die einfache Erkenntnis aus, dass aufgrund der Totalreflexion viele kleine Partikel einen erheblich größeren Anteil des Lichtes in die NIR-Vis-Sonde zurückwerfen als wenige große (Abb. 8), sodass das Ausmaß der Reflexion in direktem Zusammenhang mit der Korngröße steht.
Angewendet wird dieses Verfahren bei der Fa. Bayer/Leverkusen. Abbildung 9 zeigt den schematischen Aufbau der verwendeten Anlagen (Glatt WSG 5-15 und GPCG1-3, Niro Aeromatic MP1, jeweils mit Bühler NIR-Vis). Als Referenzmethode zur Korngrößenanalyse dient ein Sympatec Laser mit Trockendispergierung, als Referenzmethode zur Wassergehaltsbestimmung eine IR-Trocknungswaage LP 16 (Fa. Mettler).
Untersucht wurde das Granulierverhalten von Nisoldipin-haltigen Rezepturen in den verschiedenen Wirbelschichtgeräten. Als Füllstoffe wurden AvicelWz., Lactose und Maisstärke verwendet, granuliert wurde mit einer wässrigen PVP-Natriumlaurylsulfat-Lösung. Es sollte geklärt werden, ob der Granulierungsprozess ohne Änderungen von einem Wirbelschichter auf den anderen übertragen werden kann. Abbildung 10 zeigt die jeweils für dieses Granulat erhaltenen NIR-Spektren in Abhängigkeit von der Partikelgröße (X50) und dem Wassergehalt, Abbildung 11 einen komplett überwachten Granulationsprozess im Glatt WSG 15. Die Ansatzgröße beträgt 10 kg, die Sprührate 130 g/Minute. Diese Online-Messung mittels NIR-Vis besitzt die Genauigkeit der klassischen Analysenverfahren und bietet darüber hinaus die sofortige Verfügbarkeit der Daten.
Mittels dieser Prozessüberwachung konnte eindeutig gezeigt werden, dass auch bei gleicher Ansatzgröße im Laufe der Granulierung sehr unterschiedliche Feuchtegehalte im Produkt auftreten. Damit das Granulat unabhängig vom Wirbelschichter auf gleiche Weise weiterverarbeitet werden kann, sind folglich je nach eingesetztem Gerät unterschiedlich lange Trocknungszeiten notwendig.
Zusammenfassung
Die NIR-Vis-Spektroskopie birgt aufgrund ihres für Analytiker zunächst ungewöhnlichen Auswerteverfahrens ein enormes Entwicklungspotenzial. Zunächst beschränkte sich ihr Einsatz auf die Identifikation von Substanzen. Ihr Vorteil ist nicht nur die außerordentliche Schnelligkeit, mit der Analysen durchgeführt werden können, sondern liegt vor allem auch darin, dass für Reflexionsmessungen keinerlei Lösemittel oder andere Hilfsstoffe benötigt werden. Bei den heutigen Kosten für die Abwasseraufbereitung oder Sondermüllentsorgung ist dies ein nicht zu vernachlässigender Faktor.
Dem steht der große Nachteil der Methode gegenüber: Jede neue Substanz, auf die geprüft werden soll oder die bei der Bestimmung auftreten kann, muss zunächst zeitaufwändig in den Kalibrierdatensatz aufgenommen werden, um Verwechslungen mit anderen, bereits vorhandenen Stoffen ausschließen zu können. Wenn es nicht gelingt, eine neue Substanz in ein bestehendes Modell zu integrieren, muss ein völlig neues Modell entwickelt werden. Auch sollte man sich immer bewusst sein, dass diese Methode nur so genau ist, wie die Kalibrierung durch die Referenzmethode es erlaubt.
Ein noch junges Einsatzgebiet für die NIR-Vis-Spektroskopie ist die Online-Überwachung von Herstellungsprozessen, z. B. von Kristallisation, Korngrößenwachstum oder Granulierungsprozessen.
Literatur [1] H. Rein: Mikroverkapseln mit Stärke. Diss., Philipps-Universität Marburg, 1993, S. 238ff. [2] K.-J. Steffens: NIR-Vis-Analyse nativer Stärken, 45. Internationale Stärketagung, Detmold, April 1994. [3] K.-J. Steffens: Online-Überwachung und Steuerung von Wirbelschichtprozessen mittels NIR-Spektroskopie, 2. NIRS-Food-Symposium, Bonn, Juni 1999.
Weitere Übersichtsartikel: K. List, K.-J. Steffens: Überwachung und Steuerung von Granulationsprozessen mit Hilfe der Nah-Infrarot-Spektroskopie. Pharm. Ind. 58, 347 (1996). S. Goebel, K.-J. Steffens: Online-Messung der Produktfeuchte und Korngröße in der Wirbelschicht mit der Nah-Infrarot-Spektroskopie. Pharm. Ind. 60, 889 (1998). G. Radtke, K. Knop, B. Lippold: Nah-Infrarot-Spektroskopie: Grundlagen und Anwendungen aus pharmazeutischer Sicht. Pharm. Ind. 61, 848 (1999).
Wohl keine andere Analysenmethode hat in den letzten Jahren für mehr Wirbel gesorgt als die NIR-Vis-Spektroskopie. Dies liegt einerseits daran, dass dieses Analysenverfahren es erlaubt, ohne große Probenvorbereitung Identität, Reinheit und Gehalt von Substanzen und Substanzgemischen zu bestimmen, andererseits daran, dass die Auswertung der gewonnenen Daten mit Hilfe der EDV über zum Teil komplizierte mathematische Modelle erfolgt.
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