O. Kayser, A. F. Kiderlen, H. R. GelderblomAufnahme

Strategien von mikrobiellen Parasiten

Humanpathogene Mikroorganismen haben notwendigerweise Mechanismen entwickelt, die Abwehrmechanismen des Menschen zu umgehen oder zu neutralisieren. Manche Erreger versuchen, der humoralen, Antikörper- oder Komplement-abhängigen Immunabwehr zu entkommen, indem sie in körpereigene Zellen eindringen und dort persistieren. Klassische Beispiele für eine intrazelluläre Immunevasion bieten Malaria-Erreger (Plasmodium spp.) in Erythrozyten, Kryptosporidien in Epithelzellen des Gastrointestinaltraktes sowie Listerien, Toxoplasmen, Leishmanien und Mykobakterien in mononukleären Phagozyten (allgemein in Zellen des retikuloendothelialen Systems, RES).

Die intrazelluläre Persistenz eines Erregers behindert jedoch nicht nur eine effiziente körpereigene Infektabwehr, sondern wirkt auch seiner Vernichtung mit Arzneistoffen entgegen. Zum Beispiel werden nur wenige systemisch verabreichte Antibiotika als reine Substanzen von den Zellen des RES aufgenommen und können somit in intrazellulären Vakuolen oder frei im Zytoplasma gelegene Erreger gar nicht erreichen [1].

Vor diesem Hintergrund wurden in der Vergangenheit verschiedene kolloidale Wirkstoffträger - Liposomen, Virosomen, Mikro- und Nanopartikel - entwickelt, welche eine gezielte Akkumulierung von Wirkstoffen zumindest in Phagozyten ermöglichen sollen. Eine neue Strategie, die therapeutische Effizienz schwer löslicher Wirkstoffe zu verbessern, ist deren Formulierung als Nanosuspension. Dieses Verfahren wird beispielsweise bei den Wirkstoffen Atovaquon oder Aphidicolin erprobt, die gegen Leishmania donovani wirksam sind.

Makrophagen und Immunsystem

Makrophagen sind Leukozyten mit ungelapptem Zellkern, welche phagozytotisch aktiv sind und daher dem zellulären Immunsystem zugezählt werden. Hier erfüllen sie drei wesentliche Funktionen:

• Durch ihre spontane Befähigung, Zellen, Mikroorganismen oder leblose partikuläre Substanzen aufzunehmen und zu vernichten, sind sie Elemente des unspezifischen Immunsystems.
• Da diese Befähigung auch aktivierbar ist, spielen sie auch eine wichtige Rolle im spezifischen Immunsystem, gewissermaßen als Effektoren.
• Schließlich können Makrophagen durch Aufnahme, Prozessierung und Expression von Fremdantigen antigenspezifische Lymphozyten aktivieren und somit eine spezifische Immunreaktion einleiten.

All diesen wichtigen Abwehrfunktionen zum Trotz haben Leishmanien gerade Makrophagen als ihre obligaten Wirtszellen gewählt (Abb. 1).

Leishmanien und Makrophagen

Leishmanien sind begeißelte Protozoen (Flagellaten, Mastigophora), die in Menschen und einer Vielzahl weiterer Säugetiere parasitieren. Sie verursachen Tropenkrankheiten wie die Aleppo- oder Orientbeule (kutane Leishmaniose), Kala-Azar (viszerale Leishmaniose) und Espundia (mukokutane Leishmaniose) [2].

Leishmaniosen sind weltweit - mit Ausnahme von Australien - in tropischen bis mediterranen Klimazonen endemisch. Seit einigen Jahren wird in mehreren südeuropäischen Ländern ein Anstieg der viszeralen Leishmaniose (Erreger: L. infantum) als opportunistische Infektion bei AIDS-Patienten registriert [3].

Leishmanien werden von Makrophagen phagozytiert, aber nicht zerstört, denn sie haben Mechanismen entwickelt, die sie vor den katabolen Enzymen und zytotoxischen Substanzen in den parasitophoren Vakuolen von Makrophagen schützen. Zudem sind sie in den Makrophagen vor der humoralen Infektabwehr, der Bindung spezifischer Antikörper oder der Aktivierung des Komplementsystems geschützt.

Nanosuspensionen als partikuläre Wirkstoff-Carrier

Die Strategie, Nanosuspensionen als "Drug Targeting-System" zu verwenden, nutzt das natürliche Verhalten der Makrophagen, partikuläre Substanzen zu phagozytieren und dann bevorzugt in Phagosomen anzureichern, aus. Phagosomen sind Zellorganellen, in denen sich die Leishmanien aufhalten: Sie fungieren als "parasitophore Vakuolen". (Durch Fusion mit Lysosomen bilden sie Phagolysosomen.)

Ziel dieser Studie ist es, zu dokumentieren,

• ob die Wirkstoff-Nanopartikel durch Leishmania-infizierte Makrophagen aufgenommen werden,
• wo sie sich intrazellulär lokalisieren und
• ob sie auf die Parasiten wirken.

Phagozytierung der Nanosuspensionen

Für elektronenmikroskopische Studien wurden Atovaquon [4] (Abb. 2) und Aphidicolin [5] als Nanosuspensionen prozessiert. Nach Inkubierung einer murinen Makrophagen-Zelllinie (RAW 264.7) in einer Aphidicolin-Nanosuspension (0,5%) zeigte sich bei einigen Makrophagen innerhalb von 6 Stunden deutlich die Aufnahme der Wirkstoff-Nanopartikel (Abb. 3, oben). Nach 24 Stunden enthielten die meisten Makrophagen mehrere solcher Nanopartikel (Abb. 3, unten).

Charakteristisch ist, wie sich die Makrophagen die Nanopartikel einverleiben: Mit Ausläufern ihrer Membran umfließen sie die in ihrer Nähe befindlichen Nanopartikel und fangen sie ein, sodass sich kleine partikelhaltige Vesikel bilden (Abb. 4). Anscheinend ist die weitere Verteilung der Nanopartikel im Zytoplasma der Makrophagen nicht beliebig, sondern sie wandern gezielt in die parasitophoren Vakuolen und reichern sich dort an. Hier entfalten sie ihre Wirkung, worauf tote, osmotisch aufgequollene Leishmanien mit desintegrierten Innenstrukturen hinweisen (Abb. 5). Leishmanien nehmen ihre Nahrung bevorzugt an der Geißeltasche auf. Interessanterweise konnten auch an dieser Stelle die typischen Strukturen der Atovaquon-Nanopartikel gefunden werden (Abb. 6).

Literatur [1] Maurin, M., Raoult, D.: Optimum treatment of intracellular infection. Drugs 52, 45-59 (1996). [2] Kayser, O., Croft, S. L., Kolodziej, H.: Chemotherapie der Leishmaniose und humanen Trypanosomose: Status und neue Entwicklungen. Pharm. Unserer Zeit 28, 177-185 (1999). [3] Alvar, J., Canavate, C., Gutierrez-Solar, B., Jimenez, M., Laguna, F., Lopez-Velez, R., Molina, R., Moreno, J.: Leishmania and human immunodeficiency virus coinfection: the first 10 years. Clin. Microbiol. Rev. 10, 298-319 (1997). [4] Schöler, N., Krause, C., Kayser, O., Müller, R. H., Hahn, H., Liesenfeld, O.: In vitro efficacy of atovaquone nanosuspensions against Toxoplasma gondii. Proceedings 3rd World Meeting APV/APGI, Berlin 3.-6. 4. 2000, p. 331-332. [5] Kayser, O.: Nanosuspensions for the formulation of aphidicolin to improve drug targeting against Leishmania infected macrophages. Int. J. Pharm. 196, 253-256 (2000).