U. Holzgrabe et. al.Verunreinigung von Arzneistoffen

Dabei stellte sich heraus, dass durchschnittlich 40% der Präparate nicht den Wirkstoff, sondern Milchpulver und andere Plazebos enthielten [2]. Die Zahl der Beispiele lässt sich beliebig fortsetzen. Während in Afrika und Asien der größte Anteil der gefälschten Medikamente zur Gruppe der Antibiotika gehört, findet man in unseren Breiten zumeist gefälschte anabole Steroide und Viagra [3].

Präparate mit schlechter Qualität

Fließend sind die Übergänge von den oben genannten Fälschungen zu Arzneimitteln, in denen die Arzneistoffe in einer unterdurchschnittlichen Qualität enthalten sind, d. h. in einer Qualität, die den Arzneibüchern, sei es dem Europäischen oder dem Amerikanischen Arzneibuch, nicht entspricht.

Eine Gruppe von Wissenschaftlern aus dem Vereinigten Königreich, Thailand und Nigeria untersuchte 581 Antibiotika-Proben, die sie in nigerianischen Apotheken in Lagos und Abuja gesammelt hatte.

Die Proben, die von Herstellern aus Belgien, China, Ägypten, Deutschland, Holland, Indien, Malaysia, Nigeria, Pakistan, Rumänien, Schweiz und Großbritannien stammten, entsprachen zu 48% nicht den Arzneibuchanforderungen (Brit. Pharm.), wobei Proben mit zu wenig und zu viel Wirkstoff gefunden wurden [4].

Die Proben aus den sog. Erste-Welt-Ländern erwiesen sich als genauso unpräzise wie die Proben aus den Entwicklungsländern. Das zeigt auf, dass das Problem gefälschter und qualitativ schlechter Arzneimittel in Europa und Amerika ebenso ernst zu nehmen ist wie in Afrika und Asien.

In Zeiten, wo dem Versandhandel das Wort geredet wird und wo am Arzneimittel in jeder Hinsicht gespart werden soll, wächst die Gefahr von Fälschungen und der Verschlechterung der Arzneimittelqualität. Die Pharmaindustrie versucht die Produktionskosten zu senken, indem die "active pharmaceutical ingredients" (kurz API genannt) aus Asien bezogen werden.

D. h. konkret, dass deutsche Pharmafirmen die APIs von Zwischenhändlern in Europa beziehen, die die APIs wiederum von Brokern z. B. in China oder Indien kaufen, die die Arzneistoffe von vielen verschiedenen kleineren Produktionsstätten sammeln. Diese Hersteller sind häufig gar nicht dafür ausgerüstet, komplexe Arzneistoffe auf hohem synthetischen Niveau oder z. B. fermentativ lege artis zu produzieren [5].

Nicht selten werden auch andere als die vom Innovator benutzten Synthesen beschritten. Ist das kritisch? Von der Gesetzeslage her nicht, da die europäischen Arzneimittelhersteller verpflichtet sind, die Qualität der verwendeten Arzneistoffe zu prüfen. Dazu finden zumeist Arzneibuchmethoden Anwendung, die bei der Reinheitsprüfung auf einen bestimmten Herstellungsweg, z. B. bestimmte Synthesen, zielen; wird dieser jedoch bei der Herstellung in Asien nicht beschritten, greift die Analytik ins Leere. Qualität lässt sich eben nicht nachträglich in einen Stoff hineinprüfen.

Nun müsste man den Herstellungsweg eigentlich aus dem Zertifikat entnehmen können, das jede Charge eines API begleiten muss. Da Zwischenhändler häufig die Ware umpacken und dies definitionsgemäß ein Herstellungsprozess ist, geht auf dem Vertriebsweg immer wieder die im ursprünglichen Zertifikat niedergeschriebene Information verloren.

Das ist für eine besondere Ware, wie es Arzneistoffe sind, bemerkenswert, bedenkt man, dass im Unterschied dazu für ein Schweineschnitzel der Vertriebsweg bis zum Zuchtbetrieb exakt zurückverfolgbar sein muss. Nun stellt sich die Frage, wie groß der Anteil an Arzneistoffen ist, der nicht in Europa, sondern in Asien produziert wird. Bei Antibiotika und insbesondere auf dem Generika-Markt schätzt man den Anteil auf mehr als achtzig Prozent.

Bevor an dieser Stelle einige Beispiele näher diskutiert werden, soll zuerst die Definition von Verunreinigungen gegeben werden, wie sie die Internationale Konferenz für Harmonisierung (ICH) in ihrer Richtlinie Q6A gibt:

Sie werden als

• organische Verunreinigungen wie Ausgangsstoffe und Nebenprodukte der Synthese, Abbauprodukte und Reagenzien, Liganden und Katalysatoren sowie
• anorganische Verunreinigungen wie Schwermetalle, anorganische Salze, Reagenzien, Liganden, Katalysatoren und andere Materialien, und
• Restlösungsmittel

klassifiziert. Die Transparenzliste der neueren Monographien des Europäischen Arzneibuches (Ph. Eur.) gibt Auskunft über potenzielle organische Verunreinigungen.

Dokumentierte Fälle

Beispiel Erythromycin

1998 wurde im Zentrallaboratorium der Deutschen Apotheker festgestellt, dass zahlreiche Chargen Erythromycin verschiedener Produzenten im Handel waren, die beträchtliche Mengen Lösungsmittel, und zwar 1,2-Dichlorethan, Dichlormethan, Chloroform, Xylol und Ethylbenzol, sowie unzulässige Mengen verwandter Substanzen enthielten [7], obgleich die Proben laut den Analysenzertifikaten den Anforderungen des Arzneibuches entsprachen.

Beispiel Trimethoprim

Die Untersuchung von Trimethoprim-Chargen von fünf Herstellern aus drei Ländern mithilfe einer Reversed-Phase-HPLC mit Gradientenelution ergab in den Neunzigerjahren zwei neue Verunreinigungen, die mit der in der USP beschriebenen DC-Methode nicht gefunden worden waren (Abb. 1).

In einigen Chargen waren die Verunreinigungen bis zu 2,1% enthalten, in anderen gar nicht [8]. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Hersteller verschiedene Synthese- und Reinigungsmethoden benutzt haben. Dem entgegenzuwirken ist schwierig; eine Möglichkeit ist, die wenig empfindliche und unselektive Dünnschichtchromatographie gegen HPLC-Methoden auszutauschen.

Beispiel Tryptophan

Bei der Anwendung von Tryptophan, das sowohl als Arzneistoff als auch als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt wird, wurde 1989 an einer Vielzahl von Patienten das Eosinophilie-Myalgie-Syndrom beobachtet, das bei ca. 30 Personen zum Tode führte. Man konnte die Chargen zurückverfolgen und dabei festmachen, dass die Erkrankung nur bei den Patienten auftrat, die Tryptophan eines ganz bestimmten japanischen Herstellers eingenommen hatten [9].

Dieser hatte Tryptophan nicht synthetisch, sondern fermentativ mithilfe neuer Stämme von Bacillus amyloliquefaciens hergestellt und außerdem die Menge Aktivkohle, mit der Tryptophan gereinigt wird, reduziert. Nachdem die Chargen dieses Herstellers vom Markt genommen worden waren, traten keine weiteren Fälle des Eosinophilie-Myalgie-Syndroms mehr auf.

Nun konnte man daran gehen, nach der Ursache der Erkrankung zu suchen. Schnell wurde mittels HPLC ein so genannter "Peak E" gefunden, der als 1,1-Ethylidenbistryptophan identifiziert werden konnte [10 – 12], eine zweite Verunreinigung "Peak UV-5", bei der es sich um 3-Phenylamino-l-alanin handelt [13], und 2-(3-Indolylmethyl)-l-tryptophan (Abb. 2) [14].

Zu der für Aminosäuren üblichen Prüfung auf "Ninhydrin-positive Substanzen" gesellte sich im Arzneibuch eine HPLC-Methode, die in der Lage ist, die oben genannten neuen Verunreinigungen im ppm-Bereich zu begrenzen. Außerdem wurde die Liste der Verunreinigungen im Europäischen Arzneibuch ergänzt.

Letztlich wird aber bis heute diskutiert, ob diese Verunreinigungen das vorher nicht gekannte Eosinophilie-Myalgie-Syndrom verursachen. Deshalb gehen die analytischen Studien weiter [15 – 16]. Ähnliche Beobachtungen wie beim Tryptophan wurden für das Hydroxytryptophan gemacht.

Beispiel Aminosäuren

Aminosäuren werden – wie bei Tryptophan bereits erwähnt – heute mit verschiedensten Methoden hergestellt. Neben den klassischen Totalsynthesen, wie z. B. der Strecker-Synthese, gibt es sowohl fermentative Methoden als auch die Hydrolyse von Peptiden mit anschließender Auftrennung in die verschiedenen Aminosäuren (Abb. 3) [17].

Diesen verschiedensten Herstellungsmethoden trägt die Reinheitsanalytik im Arzneibuch zurzeit nicht Rechnung. Zumeist wird nur auf Ninhydrin-positive Substanzen mittels Dünnschichtchromatographie getestet, d. h. grob gesagt auf andere Aminosäuren. Die Methode ist weder selektiv noch empfindlich. Sie hat eine Nachweisgrenze von 0,5%; eine Summenbegrenzung aller Verunreinigungen ist gar nicht möglich.

In zwei Beziehungen sollte die Prüfung auf "verwandte Substanzen" verbessert werden. Einerseits sollten andere Aminosäuren empfindlicher nachgewiesen werden, um sie auf dem im Arzneibuch üblichen Level von 0,1 Prozent begrenzen zu können. Andererseits sollte auf Verunreinigungen getestet werden, die z. B. durch eine Fermentation in die Substanz gelangen können, d. h. z. B. auf Aminozucker, Di- und Tripeptide oder Nukleinsäuren. Bei solchen Untersuchungen wurde unter anderem für Histidin eine Vielzahl verschiedenster Verunreinigungen gefunden, die im Test auf Ninhydrin-positive Substanzen nicht sichtbar waren [18 –19].

Die meisten anderen zu erwartenden Verunreinigungen enthalten primäre Aminogruppen, die man zur Derivatisierung und damit für die Detektion in HPLC oder Kapillarelektrophorese nutzen kann. Die Verwendung von 3-(4-Carboxybenzoyl)-chinolin-2-carbaldehyd (CBQCA) mit Natriumcyanid ergibt fluoreszierende Derivate (Anregung 488 nm, Emission 520 nm), die sich mittels mizellarer elektrokinetischer Chromatographie (MEKC), einer Sonderform der Kapillarelektrophorese (CE), gut voneinander trennen lassen (Abb. 4).

Die entsprechenden Elektropherogramme von Histidin verschiedener Hersteller sind in Abbildung 5 dargestellt.

Vergleicht man die Ergebnisse dieses Verfahrens mit den Ergebnissen der Prüfung auf Ninhydrin-positive Substanzen, so ergibt sich das in Tabelle 1 für einige Aminosäuren dargestellte Bild. Mit der Arzneibuchmethode wurden gar keine Verunreinigungen gefunden, mit der MEKC-Methode wurden in allen untersuchten Proben gleich mehrere Verunreinigungen nachgewiesen. Das heißt, dass eine Veränderung des Produktionsweges – wie man ihn z. B. bei Tryptophan vorgenommen hatte – mit der bisher beschriebenen Testmethode nicht festgestellt werden kann und ein erneuter "Tryptophanfall" durchaus denkbar ist.

Beispiel Gentamicin

Im Mai 2000 wurde in den USA berichtet, dass 17 Patienten nach einem "Off-label-use" von Gentamicin gestorben waren; später wurden 66 Todesfälle durch Gentamicin genannt [20]. Dies Ereignis initiierte die Untersuchung von über 40 Chargen verschiedenster Lieferanten von Gentamicin und Hersteller von Gentamicin enthaltenden Arzneimitteln aus dem europäischen und amerikanischen Raum, um Unterschiede in den Chargen aufzudecken.

Da die im Arzneibuch beschriebene Reinheitsanalyse (Ph. Eur. 4.6) eine HPLC-Methode mit pulsamperometrischer Detektion beinhaltet, die laut Aussage des Entwicklers [21] nicht sehr robust ist, wurde die Proben mittels einer von Hoogmartens beschriebenen CE-Methode [21] sowie einer neuen MEKC-Methode [24], deren Hintergrundelektrolyt aus α-Cyclodextrin und Desoxycholsäure in Boratpuffer besteht, untersucht. Da beide Methoden sich für die Detektion einer Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd und Thioglycolsäure bedienen und deshalb der Response-Faktor ein Problem darstellt, wurden zusätzlich alle Proben NMR-spektroskopisch vermessen.

Mithilfe dieser drei Methoden konnten die Chargen in sieben Gruppen eingeteilt werden, die sich nicht nur in der Zusammensetzung der Hauptkomponenten des Gentamicins, C1, C1a, C2, C2a, und der Nebenkomponente C2b unterschieden, sondern auch Verunreinigungen der Transparenzliste von Gentamicin wie Garamin (GA), Desoxystreptamin, JI-30B, Sisomicin (und Netilmicin) sowie nicht identifizierte Verunreinigungen beinhalteten (Abb. 6).

Bemerkenswerterweise enthielten alle Proben, die eine große Zahl an Verunreinigungen in relativ hohen Konzentrationen aufwiesen, fast immer Sisomicin; umgekehrt wiesen Proben, die kein Sisomicin enthielten, auch nur wenige weitere Verunreinigungen in kleinen Konzentrationen auf (zu weiteren Details siehe [22 – 24]).

Das wohl wichtigste Ergebnis der Studie ist,

• dass einige Komponentenmuster in Chargen verschiedensten Ursprungs gefunden wurden, d. h., dass verschiedene Arzneimittelhersteller beim gleichen Arzneistoffproduzenten gekauft haben, und
• dass Proben gleichen Ursprungs verschiedene Muster zeigten, was bedeutet, dass ein Arzneimittelhersteller bei verschiedenen Produzenten gekauft hat.

Nur zum Teil war der Weg der Chargen von China nach Europa nachvollziehbar (Abb. 7). Die vermeintlich unreinen Proben sind auch die Proben, die in Amerika beim "Off-label-use" die Todesfälle verursacht haben.

Impurity Profiling

Die oben genannten Fälle sind repräsentativ für viele andere: So wurden z. B. in Diclofenac-Natrium von Generika-Herstellern, das einen unangenehmen Geruch aufwies, große Mengen N-Phenyl-2,6-dichloranilin gefunden [25]. In gefälschtem Carbamazepin wurde eine Vielzahl von neuen Verunreinigungen gefunden, aber nicht die in der Ph. Eur. mitgeteilten, was auf einen anderen Herstellungsweg hindeutet [26]. Ähnliche Berichte gibt es z. B. für Fluoxetin [27], Pethidin [28], Fluorescein, Dequaliniumchlorid [29] und Trospiumchlorid [26].

Wie stellt man nun fest, ob ein Arzneistoff nicht nach dem in der Zulassung beschriebenen Weg hergestellt wird? Wie überprüft man, ob eine neue, ggf. toxische Verunreinigung nicht unter einem anderen Peak im HPL-Chromatogramm liegt oder unterhalb der Berichtsschwelle ("Disregard Limit") und damit nicht identifiziert werden muss?

Mittels chromatographischer und anderer in den Arzneibüchern beschriebener Methoden untersucht man das Profil der Restlösungsmittel, der Schwermetalle (enthalten aufgrund des Gebrauches von Katalysatoren, entsprechenden Reaktionsgefäßen) oder den Wassergehalt. Sind die Profile von denen, die mit dem ursprünglichen Herstellungsweg erzielt wurden, verschieden, so kann man mit großer Wahrscheinlichkeit auf einen veränderten Herstellungsweg schließen, auch wenn die Proben in Bezug auf den Test auf "Verwandte Substanzen" den Arzneibuchanforderungen entsprechen.

Auch ein veränderter "Fingerprint" in NIR-Spektren oder NMR-Spektren, die zusätzliche Signale zeigen, können Hinweise auf veränderte Herstellungswege sein. Manche Firmen – wie z. B. Lilly in den USA – messen inzwischen routinemäßig NMR-Spektren neuer Arzneistoffchargen und haben ganze Bibliotheken von Spektren mit zusätzlichen, nicht zum jeweiligen Arzneistoff gehörenden Signalen, um "unreine" Ware gleich zu erkennen und sich vor dieser zu schützen.

An dieser Stelle muss über die Anwendbarkeit der im Arzneibuch beschriebenen Methoden nachgedacht werden, da sie eventuell die neuen Verunreinigungen weder vom Hauptpeak abtrennen noch quantifizieren kann. Gekoppelte Techniken wie GC-MS, LC-MSn, LC-NMR, LC-MS-NMR oder SPE-MS-NMR können beim Impurity Profiling helfen, neue unbekannte Verunreinigungen zu identifizieren.

Danksagung

Dem Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) sei für die finanzielle Unterstützung der Aminosäuren- und Gentamicin-Untersuchungen gedankt und Herrn Dr. D. Schnädelbach und Frau Dr. S. Keitel, beide BfArM, für die zahlreichen fruchtbaren Diskussionen.