Herstellung rekombinanter therapeutischer Proteine

Rekombinate therapeutische Proteine sind große Moleküle, die aus zahlreichen Aminosäuren bestehen und eine komplexe dreidimensionale Struktur aufweisen. Die durch Peptidketten verbundenen Aminosäuren formen die Primärstruktur, die sich je nach Faltung zu einer bestimmten Sekundärstruktur anordnet, deren räumliche Ausrichtung als Tertiärstruktur bezeichnet wird. Diese großen Proteine können zwar sequenziert werden, ihre biologischen und immunologischen Eigenschaften hängen indes von ihrem Herstellungsprozess ab, aus dem eine mikroheterogene Mischung unterschiedlicher molekularer Spezies hervorgeht. Zahlreiche Variationsmöglichkeiten führen zu einem Gemisch, das aus 108 möglichen Formen besteht. Diese Varianten lassen sich durch analytische Verfahren nicht ausreichend charakterisieren. Umso wichtiger ist ihre validierte Herstellung, um eine konsistente, reproduzierbare Qualität zu erzeugen.

"Product by process"

Der erste Schritt ist das Einbringen der genetischen Information in eine geeignete Wirtszelle. Eine für das gewünschte Protein kodierte DNS-Sequenz wird in die Wirtszelle – meist eine chinesische Hamster-Ovarialzelle (CHO) – eingebracht und veranlasst diese, das Protein zu bilden. Der Nachweis, ob sich das gewünschte Gen tatsächlich in der Wirtszelle befindet, erfolgt über die FISH-Technologie. Die Wirt-Vektor-Kombination, die in ihrer genetischen Struktur charakterisiert und validiert ist, bildet die Produktionszelllinie und wird als Master Cell Bank angelegt, aus der eine oder mehrere Arbeitsbänke hergestellt werden. Die Wirtszelle und die angelegten Werkbänke müssen genetisch und mikrobiologisch genau charakterisiert sein. Die Zellen werden eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Soll nun das gewünschte Biopharmazeutikum produziert werden, werden die Zellen aufgetaut und mit einem geeigneten Wachstumsmedium versetzt. In einer Vorkultur erfolgt die Vermehrung der Zellen, um die erforderliche Zellzahl für das Animpfen zu erhalten. Im Produktionsbioreaktor erfolgt dann die Expression des Proteins durch die Produktionszelllinien. Eingesetzt werden meist Bioreaktoren aus Edelstahl. Neue Entwicklungen sind Einwegsysteme aus Kunststoff, bei dem alle Hilfsmittel, die mit dem Produkt in Berührung kommen, nur einmal verwendet werden.

Ernte und Reinigung

Im Bioreaktor liegt ein geschlossenes System vor, in dem das gewünschte Protein über einen monatelangen Zeitraum hinweg produziert wird, wobei diverse Parameter wie pH-Wert, Temperatur und Zusammensetzung des Nährmediums regelmäßig kontrolliert werden. Das erzeugte Protein wird an das Medium abgegeben und kann anschließend geerntet werden. Um ein einheitliches Produkt ohne Verunreinigungen oder Aggregatansammlungen zu erhalten, wird das Protein nach Abtrennen des Mediums chromatographisch gereinigt. Dem schließt sich eine Nanofiltration an. Der letzte Schritt besteht aus einer Diafiltration in einen Puffer, in dem das Produkt bis zur aseptischen Abfüllung gelagert werden kann.

Kontinuierliche Kontrolle

Das gebildete Protein wird abschließend auf seine immunologischen, chemischen und biologischen Eigenschaften hin untersucht und Wirksamkeit, Sicherheit und Reinheit werden überprüft. Besonderes Augenmerk gilt dem Ausschluss einer viralen Kontamination. Um das potenzielle Risiko zu minimieren, werden während des ganzen Herstellungsprozesses Untersuchungen durchgeführt. So müssen Zell- und Arbeitsbänke überprüft und die geernteten Zellen nach jedem Produktionslauf auf Abwesenheit von Viren getestet werden. Eine weitere Sicherheitsstufe ist das Aufreinigungsverfahren, bei dem ebenfalls potenzielle Verunreinigungen beseitigt werden.

Quelle 

_{Dr. Klaus Bernhard Schoepe, Laupheim: "Herstellung rekombinanter therapeutischer Proteine", beim 32. Heidelberger Kongress der Landesapothekerkammer Baden-Württemberg, 21. November 2009.}

Apothekerin Dr. Petra Jungmayr