Pharmazie

Ergebnis in 30 Minuten

Die Genschere und die SARS-CoV-2-Schnelldiagnostik

Remagen - 15.10.2020, 10:45 Uhr

Ein wesentlicher Fortschritt der neu entwickelten Testmethode wäre die einfache Handhabbarkeit der Fluoreszenzmessung mit Hilfe der Kamera eines Mobiltelefons – „optimal für das Point-of-Care SARS-CoV-2 Screening“, so die Wissenschaftler. (Foto: vchalup / stock.adobe.com)

US-Wissenschaftler haben einen Schnelltest zum Nachweis von SARS-CoV-2 entwickelt, der schon innerhalb weniger Minuten ein Ergebnis liefern soll. Und zwar nicht nur dazu, ob eine Infektion vorliegt oder nicht, sondern auch zum Umfang der Viruslast. Sie nutzen hierfür die Methode der Genschere, deren Entwicklung gerade erst mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde.

Die aktuelle Gold-Standard-Diagnostik für SARS-CoV-2-Infektionen beruht auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Diese ist sehr zeitaufwendig und ohne Labor nicht möglich. Außerdem kann sie wegen ihrer hohen Empfindlichkeit unter Umständen zu einer unnötigen Identifizierung von SARS-CoV-2 RNA-positiven Personen führen, die tatsächlich gar nicht mehr infektiös sind. Diese beiden Nachteile wollen die Forscherteams um Daniel Fletcher von der University of California in Berkeley und Melanie Ott vom J. David Gladstone-Institute in San Francisco mit ihrem neuen Testprinzip überwinden. Sie nutzen hierfür die CRISPR/Cas-Methode (Genschere), deren Entwickler, die Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, gerade erst mit dem diesjährigen Nobelpreis für Chemie belohnt wurden.

Nobelpreis für die „Genschere“ CRISPR/Cas9

Jennifer Doudna gehört dem Forscherteam an, das den Test entwickelt hat. Die molekularbiologische Methode, mit der Gene gezielt eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet, oder auch Nukleotide in einem Gen geändert werden können, leitet sich von einem Mechanismus ab, mit dem sich Bakterien dauerhaft vor schädlichen Viren schützen. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) steht für Abschnitte sich wiederholender kurzer DNA-Sequenzen (repeats), die im Erbgut vieler Bakterien auftreten, Cas (CRISPR-associated) für das Erbgut-schneidende Enzym. Bei einer Infektion von Bakterien spalten die Cas-Proteine die DNA der eingedrungenen Viren in kleine Fragmente auf. Diese werden dann in CRISPR-Abschnitte eingefügt. Bei einem erneuten Virenbefall werden die Abschnitte in RNA umgeschrieben, die dann eine neu eintretende Viren-DNA prüft. Stimmt sie mit dem gespeicherten Abschnitt überein, so wird sie durch die Cas-Proteine zerschnitten.

Eigentlich nichts Neues

Was sich ursprünglich als erfolgreiche Strategie bei Bakterien entwickelte, um eingedrungene Phagen zu zerstören und ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen, wird nun für die Virusdiagnostik genutzt, schreiben die kalifornischen Autoren. Wie aus ihrer Publikation hervorgeht, ist die Anwendung der Genschere in der Diagnostik nicht neu. Allerdings basieren aktuelle CRISPR-Diagnosestrategien auf der vorherigen Amplifikation der Ziel-RNA für die nachfolgende Detektion durch ein Cas-Protein. Dies ist notwendig, um eine ausreichend hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Der neue CRISPR-Cas13a-basierte Assay, über den die kalifornischen Wissenschaftler berichten, soll im Gegensatz zur bisherigen CRISPR-Diagnostik für den Nachweis des viralen Genoms keine vorherige Amplifikation erfordern.

Wie der neue Corona-Test funktioniert

Der neue Assay führt also deutlich schneller zum Ergebnis. Das Prinzip funktioniert so: Um das Zielgen zu finden, nutzt die CRISPR/Cas-Methode eine Leit-RNA (crRNA), die in einen Effektorkomplex mit der eigentlichen Genschere Cas13 integriert ist. Nach Anlagerung des Komplexes an das Virusgen wird dieses von Cas13, zerschnitten. Dabei wird eine Reporter-RNA freigesetzt, die mit einem Fluoreszenzmarker versehen ist. Die Intensität der erzeugten Fluoreszenz wird einfach mit einer Handykamera eingefangen.

Bisherige CRISPR-Diagnosestrategien

Bereits vor einigen Jahren wurde die sogenannte „SHERLOCK“-Methode entwickelt, bei der für die Detektion Cas13a oder Cas13b eingesetzt werden. Sie wurde kürzlich für den Nachweis der SARS-CoV-2-RNA angepasst und als „SHINE“ bereits für die Analyse von nicht extrahierten Proben weiterentwickelt.

Die Umwandlung von amplifizierter DNA zurück in RNA kann vermieden werden, indem das DNA-sensitive Cas12 zum Nachweis verwendet wird, eine Methode namens „DETECTR“, die ebenfalls schon für die Detektion von SARS-CoV-2 adaptiert wurde.

Sowohl SHERLOCK- als auch DETECTR-Reaktionen dauern nach Darlegung der Forscher etwa eine Stunde und können mit papierbasierten Durchflussstreifen ausgelesen werden, die für den Point-of-Care-Einsatz geeignet sind. Die von der FDA aktuell zugelassenen Protokolle sind allerdings immer noch laborbasiert.

Als wichtigen Fortschritt heben die Forscher hervor, dass sie Kombinationen von mehreren crRNAs verwendeten, was die Empfindlichkeit der direkten Erkennung erhöht. Mit der passenden Kombination, die sie in aufwändigen Versuchsreihen ermittelten, konnten sie die virale SARS-CoV-2 RNA in der Größenordnung von
100 Kopien/μL innerhalb von 30 Minuten detektieren. Fünf SARS-CoV-2 positive Patientenproben (Ct-Werte von 14,37 bis 22,13; der Ct-Wert gibt an, wie viele Durchläufe es beim PCR-Test braucht, bis das Coronavirus in einer Probe identifiziert werden kann) konnten innerhalb von fünf Minuten korrekt identifiziert werden. Außerdem soll die Verwendung mehrerer crRNAs, die auf verschiedene Teile des Genoms abzielen, verhindern, dass natürlich vorkommende Virusmutationen nicht erfasst werden.

So funktioniert die Quantifizierung der Viruslast

Überdies liefert der Test nicht nur ein positives oder negatives Ergebnis. Er soll auch anzeigen, wie hoch die Viruslast in der Probe ist. Diese spiegelt sich in der Intensität der Fluoreszenz wider, die damit auch zur Quantifizierung verwendet werden kann. Mit dem Test könnte der Verlauf der Infektion eines Patienten sukzessive überwacht werden, zum Beispiel um festzustellen, wie lange eine Person noch ansteckend ist, so die Hoffnung der Wissenschaftler.

Aufregung um „CRISPR“-Babys

Einfache Erfassung mit dem Handy

Als weiteren wesentlichen Fortschritt bezeichnen sie die einfache Handhabbarkeit der Fluoreszenzmessung mit Hilfe der Kamera eines Mobiltelefons, optimal für das Point-of-Care SARS-CoV-2 Screening. Kombiniert mit ihren Konnektivitäts-, GPS- und Datenverarbeitungsfunktionen könnten Mobiltelefone ihrer Meinung nach zu attraktiven Werkzeugen für die Überwachung des epidemiologischen Geschehens werden. Durch die vier Attribute „einfach, robust, wirtschaftlich und weit verbreitet“ könnten sie auch in ressourcenarmen Regionen eingesetzt werden. Verfügbar ist der neue Test allerdings noch nicht, denn er befindet sich im Entwicklungsstadium. Es wird also noch weitere Studien brauchen, bis er tatsächlich in der Praxis ankommt.