Bestimmung von Substanzen in biologischem Material

Aufgaben der Bioanalytik

• die Analyse von Arzneistoffen und deren Metaboliten in Körperflüssigkeiten und Geweben als Grundlage für Therapiekontrolle und -optimierung (Drug Monitoring),
• das Screening von Körperflüssigkeiten hinsichtlich körperfremder Substanzen, in der Regel für einen toxikologischen Befund,
• die Bestimmung von physiologischen Stoffen, Stoffwechselprodukten und Elektrolyten, um eine Therapieanpassung zu ermöglichen,
• forschungsbegleitende Analytik.

Chromatographische Methoden

• Dünnschichtchromatographie (DC),
• Gaschromatographie (GC),
• Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).

DC ist einfach und schnell durchführbar. Rf-Wert und Farbreaktionen charakterisieren eine Substanz. Zahlreiche Arzneistoffe können im Serum oder Plasma durch quantitative DC bestimmt werden. Grundsätzlich sind GC und HPLC für quantitative Fragestellungen besser geeignet. Für den qualitativen Nachweis von Drogen im Urin gibt es standardisierte DC-Verfahren und Schnelltests, die auf dem Prinzip der Immunchromatographie beruhen.
Die wesentlichen Komponenten der apparativen Ausstattung für GC sind Injektor, Trennsäule und Detektor. Als Detektortypen stehen Flammenionisations- (FID), Elektroneneinfang- (ECD) und Wärmeleitfähigkeitsdetektoren (WLD, TCD) zur Verfügung.
Wesentliche Komponenten jeder HPLC-Anlage sind Pumpen für die mobile Phase. Die wichtigsten Detektoren sind UV-Vis-, Fluoreszenz-, Brechungsindex- und elektrochemische Detektoren. Die Kopplung HPLC/MS ist ebenfalls möglich. Gradientenelution kann die Trennleistung der HPLC verbessern. Häufig werden die zu analysierenden Substanzen derivatisiert. Durch HPLC lassen sich Metaboliten trennen, die in einem Immunoassay gemeinsam erfaßt würden.

Spektroskopische Methoden

Die Flammenspektroskopie eignet sich als Routinemethode zur Bestimmung der Serumelektrolyte Na+, K+, Ca2+. Die Flammen-, Graphit(rohr)ofen- und Hydridtechnik sind Meßtechniken der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS). Die AAS gestattet
die Bestimmung von Elektrolyten und Spurenelementen mit hoher Genauigkeit.
UV-Vis-Spektroskopie läßt sich sehr gut automatisieren und in der Handhabung vereinfachen. Beispielsweise können mit Hilfe von Testblättchen, die die notwendigen Reagenzien für eine Farbreaktion enthalten, Parameter der Klinischen Chemie, aber auch Arzneistoffe im Serum analysiert werden.
Die Strahlung des infraroten Bereiches regt organische Moleküle zu Schwingungen an, die Licht bestimmter Wellenlänge absorbieren. Bei der Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) erhält man ein IR-Spektrum im Bereich 2,5-50 mm Wellenlänge ("Wellenzahl" 4000-200 cm-1). Die FTIR gestattet die qualitative und semiquantitative Bestimmung von Nierensteinen.

Immunchemische Methoden

Indirekte und direkte Methoden

Bei den direkten Verfahren mit nichtmarkierten Reaktionspartnern bilden sich Immunkomplexe, die sich durch Änderung eines Streulichtsignals nachweisen lassen.

Kompetitive und nichtkompetitive Methoden

Bei der nichtkompetitiven Technik (Immunometrische Assays) bindet das AG an eine im Überschuß vorhandene Menge AK. Bei der "sandwich method" ist dieser AK an eine Festphase fixiert. Ein weiterer markierter Antikörper (AK*) koppelt an eine zweite Bindungsstelle des AG.

Heterogene und homogene Methoden

Enzymimmunoassay (EIA)

Kompetitiver Enzymimunoassay (EIA i.e.S.)

Nichtkompetitiver immunoenzymometrischer Assay (IEMA)

Fluoreszenzpolarisations-immunoassay (FPIA)

Die emittierte Fluoreszenzstrahlung ist immer dann polarisiert, wenn die Anregung mit polarisiertem Licht erfolgt. Befinden sich die Fluoreszenzmoleküle zwischen Absorption und Emission in freier Brownscher Molekularbewegung, ist der Polarisationsgrad der emittierten Strahlung gering. Geht ein mit einem Fluoreszenzmolekül markiertes Antigen eine AG*-AK-Komplexbindung ein, nimmt die freie molekulare Rotation ab, und die Fluoreszenzpolarisation bleibt im wesentlichen erhalten.
Der FPIA ist ein homogener, kompetitiver IA. Eine Halogenlampe sendet Licht verschiedener Wellenlängen in zufälliger räumlicher Ausrichtung durch einen Interferenzfilter. Blaues Licht (481-489 nm) tritt anschließend durch einen Flüssigkristallpolarisator. Dieses polarisierte Licht regt mit Fluorescein markierte AG* zur Emission von grünem Licht (525-550 nm) an. Ist wenig AG vorhanden, ist das Ausmaß der Bindung des AG* an einen AK hoch. Die Fluoreszenzpolarisation wird im wesentlichen beibehalten. Bei geringer Komplexbindung des AG* schwingt das emittierte Licht in anderen Ebenen, der hohe Polarisationsgrad geht verloren. Die Einführung der monoklonalen Antikörper erhöhte die Sensitivität der Verfahren deutlich.
Die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten, die für den klinischen Alltag ausreichende Spezifität und Sensitivität, der schnelle und einfach durchzuführende Testablauf sowie die über mehrere Monate hinweg stabile Kalibrierung haben den FPIA zu einer Referenzmethode innerhalb der Immunoassays werden lassen.

Partikelimmunoassay

Für Arzneistoffbestimmungen ist das PETINIA(r)-Prinzip ("particle enhanced turbidimetric inhibition immunoassay") geeignet. Hier werden monovalente AG (Arzneistoffe, Steroidhormone) an Partikel gebunden. Diese dann polyvalenten Antigenpartikel bilden mit AK lichtstreuende Immunkomplexe, deren Zusammenlagerung durch Zugabe von Probenantigen behindert wird. Mit wachsender Probenantigenkonzentration nimmt daher die Lichtstreuung ab. Anwendung findet dieses Verfahren bei den Arzneistoffen Carbamazepin, Digoxin, Theophyllin, Gentamicin, Tobramycin und Phenytoin.

Qualitätssicherung

Die Meßunsicherheit einer Methode umfaßt alle Abweichungen, die durch systematische und zufällige Fehler bedingt sind. Sie wird bestimmt durch die Präzision und Richtigkeit eines Verfahrens.

Interne und externe Qualitätskontrolle

externe Qualitätssicherung umfaßt die Teilnahme an Vergleichsmessungen (Ringversuche) verschiedener Laboratorien. Sie ist vom Prinzip her eine Richtigkeitskontrolle. Für folgende Arzneistoffe ist eine Verfahrenskontrolle nach den Richtlinien der BÄK vorgeschrieben:

• Carbamazepin,
• Digoxin,
• Phenobarbital,
• Phenytoin,
• Primidon,
• Theophyllin,
• Valproinsäure.

Literatur bei den Verfassern. Anschrift der Verfasser: Dr. Lutz Vogel, Jürgen Baumann Zentralapotheke des Landkreises Esslingen beim Paracelsus-Krankenhaus Ruit Postfach, 73744 Ostfildern

Herausgeber der DAZ-Serie Klinische Pharmazie sind Ulrich Jaehde, Berlin Roland Radziwill, Fulda Stefan Mühlebach, Aarau Walter Schunack, Berlin