H. Warzecha: Essbare Impfstoffe – Immunisierung mit Proteinen aus transgen

Wege der Immunisierung

Impfstoffe dienen in der Regel der Prävention, das heißt, sie sollen bei der immunisierten Person einen Schutz aufbauen, der sie bei Kontakt mit dem jeweiligen Erreger vor der Infektion und somit vor der Krankheit schützt. Zur Impfung können einerseits Immunglobuline verabreicht werden, die einen bestimmten Erreger neutralisieren (passive Immunisierung). Andererseits kann im Körper auch eine Immunantwort induziert, das heißt die Produktion von Immunglobulinen in Gang gesetzt werden (aktive Immunisierung), wenn er mit lebenden oder abgetöteten Erregern konfrontiert wird. Lebendimpfstoffe enthalten replikationsfähige Erreger, die sich in der geimpften Person vermehren können, aber nicht mehr virulent sind. Attenuierte (abgeschwächte) Viren ähneln den Krankheitserregern in Bezug auf Aufbau, Proteinzusammensetzung und Infektionsverhalten, verursachen aber nur eine begrenzte oder abgeschwächte Infektion. Beispiele für attenuierte Viren, die erfolgreich als Impfstoffe eingesetzt werden, sind u. a. Polio-, Masern-, Mumps-, Röteln- und Gelbfiebervirus [2]. Der Körper bildet nach einer Infektion neutralisierende Antikörper, die überwiegend gegen Oberflächenstrukturen der Erreger gerichtet sind. Sie können diese Strukturen binden, die Anlagerung an bestimmte Zelltypen unterbinden und somit den Ausbruch der Krankheit verhindern. Auch abgetötete, nicht mehr vermehrungsfähige Erreger oder Teilstrukturen (Totimpfstoffe) können diese Antikörperreaktion auslösen. Zur Steigerung der Immunantwort müssen diese Strukturen mit einem Adjuvans (Aluminiumhydroxid) appliziert werden, welches die Einwanderung von Makrophagen, Monozyten, B- und T-Lymphozyten an die Inokulationsstelle fördert. Totimpfstoffe werden derzeit gegen Influenza-, Hepatitis-A- und -B- und FSME-Viren eingesetzt. Dabei sind zur Erhaltung des Impfschutzes Wiederholungsimpfungen in relativ kurzen Abständen nötig. Neben abgetöteten Bakterien und Viren lassen sich auch einzelne Strukturelemente der Erreger als Impfstoffe einsetzen. Bakterielle Oberflächenantigene, Viruspartikel und isolierte DNA-Abschnitte sind ebenfalls in der Lage, die Bildung neutralisierender Antikörper zu induzieren.

Orale Impfstoffe

Fast alle bisher üblichen Immunisierungen werden durch Injektion des Impfstoffes durchgeführt. Diese Prozedur ist mit ein Grund für die mangelnde Akzeptanz von Impfungen, vor allem bei Kindern. Allerdings ist es nicht immer zwingend notwendig, den Impfstoff parenteral zu verabreichen. Das klassische Beispiel sind die von Albert Sabin entwickelten Poliovakzine, bei denen die attenuierten Viren auf ein Stück Zucker geträufelt verabreicht werden (Schluckimpfung). Auch gegenüber anderen Erregern kann eine Immunantwort durch die orale Gabe des Impfstoffes erzeugt und ein wirksamer Impfschutz erreicht werden. Dies betrifft vor allem Erreger, die über Schleimhäute in den Körper eindringen und z. B. durch kontaminiertes Wasser und Lebensmittel oder durch Sexualkontakt übertragen werden. Die Schleimhäute, die hier die erste Barriere des Körpers gegen eindringende Mikroorganismen darstellen, besitzen eine effektive Immunabwehr [3]. Im Gastrointestinaltrakt transportieren M-Zellen Antigene vom Lumen zu den Follikeln, in denen eine B- und T-Lymphozyten-Antwort induziert wird. Während über die Schleimhaut Antikörper sezerniert werden, wandern die aktivierten Lymphozyten zu anderen Schleimhäuten und vermitteln auch dort eine Immunisierung. Oral applizierbare Vakzine können demnach das Immunsystem der Mukosa, z. B. des Gastrointestinaltraktes oder der Atemwege, zur Produktion sekretorischer Antikörper (S-IgA) stimulieren. Geeignete Kandidaten für solche Impfstoffe sind lebende und abgetötete Erreger sowie Proteinuntereinheiten und lösliche Antigene der verschiedensten Bakterien und Viren, wie z. B. E. coli, Hepatitis-B- oder Norwalk-Viren (Erreger von Diarrhö). Verglichen mit der parenteralen Immunisierung müssen bei der oralen Impfung allerdings wesentlich größere Mengen des Antigens (Faktor 1000) eingesetzt werden [4]. Deshalb kann eine orale Immunisierung auch erst dann sinnvoll sein, wenn eine preisgünstige Produktionsmöglichkeit des Impfstoffes zur Verfügung steht.

Warum gerade Pflanzen als Impfstoffproduzenten?

Je nach Art des Erregers werden Impfstoffe auf unterschiedlichste Weise gewonnen. Viren werden in der Regel in lebenden Organismen oder Zellkulturen gezüchtet, beispielsweise FSME-Viren in embryonalen Hühnerzellkulturen oder Influenzaviren in bebrüteten Hühnereiern. Bei diesen Methoden müssen die Viren aus dem entsprechenden Gewebe gereinigt werden, was mit einem hohen technischen Aufwand verbunden ist. Oberflächenantigene verschiedener Erreger können zwar in Mikroorganismen heterolog exprimiert werden, aber auch hier ist eine anschließende gründliche Aufreinigung notwendig. Das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) wird aus Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) gewonnen und ist das erste gentechnisch hergestellte Vakzin, das beim Menschen eingesetzt wurde [1]. Alle diese Methoden sind mit großem technischen Aufwand verbunden und machen Impfstoffe relativ teuer. Darüber hinaus sind viele Impfstoffe äußerst empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen und müssen vom Produktionsort unter lückenloser Kühlung zum Empfänger gebracht werden. Gerade in Entwicklungsländern mit schlechter Infrastruktur macht dieser Umstand eine flächendeckende Impfung schier unmöglich. Pflanzen, die gentechnisch so modifiziert sind, dass sie in ihren essbaren Teilen Virushüllproteine oder bakterielle Oberflächenantigene produzieren, wären optimal zur Herstellung und Applikation oraler Impfstoffe geeignet. Es bedarf keiner weiteren Aufreinigung des Impfstoffes, weil die Pflanzenzelle ein nahezu idealer Aufbewahrungsort für die Antigene ist und sie vor Umwelteinflüssen schützt. Des Weiteren gibt es keine besonderen Voraussetzungen für die Produktion, da Landwirtschaft nahezu überall auf der Welt durchführbar ist. Die "Impfpflanzen" könnten am jeweiligen Bedarfsort in Gewächshäusern oder auf dem Feld angepflanzt, geerntet und anschließend verabreicht werden, was einen Transport über weite Strecken überflüssig macht. Der Weg von der Theorie zur Praxis ist natürlich auch in diesem Falle nicht einfach. Anhand einiger Beispiele soll gezeigt werden, welche Antigene zur Expression in Pflanzen geeignet sind und welche Probleme es zu bewältigen gilt.

Bakterielle Enterotoxine

Bestimmte Bakterienstämme, wie enterotoxische Escherichia coli (ETEC) und Vibrio cholerae, besiedeln den Dünndarm und verursachen wässrige, überaus ernste Durchfallerkrankungen. Vor allem in Entwicklungsländern verlaufen diese Erkrankungen, gerade bei Kindern, häufig tödlich. Einen geeigneten Impfstoff gibt es bisher noch nicht. Das von E. coli produzierte Enterotoxin LT ähnelt in seiner Struktur dem von V. cholerae gebildeten CT. Beide Enterotoxine bestehen aus einer A-Untereinheit und fünf B-Untereinheiten; letztere lagern sich selbstständig zu einem ringförmigen Pentamer zusammen (Abb. 2). Während die A-Untereinheit für die toxische Wirkung verantwortlich ist, binden die jeweiligen B-Untereinheiten an die Epithelzellen, ohne selbst toxisch zu sein.

Enterotoxin-Fragmente als Antigene

Für die B-Untereinheiten des CT konnte gezeigt werden, dass sie bei oraler Gabe die Bildung von sekretorischen Antikörpern induzieren [5, 6] und dass sie in großer Menge durch gentechnisch veränderte Mikroorganismen produziert werden können [7, 8].

Antigen-Expression in Pflanzen

Erste Versuche sollten klären, ob die B-Untereinheiten des LT (LT-B) von E. coli in Pflanzen in der erforderlichen Menge exprimierbar sind, ob sie ihre natürliche pentamere Konfiguration annehmen und natürlich ob das Essen solcher Pflanzen auch wirklich eine Immunisierung hervorruft. Die Kartoffel wurde für die ersten Versuche ausgewählt, weil zu diesem Zeitpunkt eine Transformation standardmäßig durchführbar war und auch geeignete Expressionsvektoren zur Verfügung standen.

• flanzen gentechnisch soweit zu verändern, dass sie das gewünschte Protein in ausreichender Menge oder sogar nur in ausgewählten Geweben, wie z. B. den Früchten, produzieren, setzt ein grundlegendes Wissen über den Stoffwechsel und die Genregulation der jeweiligen Art voraus. Verhältnismäßig wenige Pflanzen wurden bisher mit fremden Genen transformiert, und nur bei einigen reicht das Wissen über die Regulation genetischer Information aus, um Fremdproteine gezielt und in großer Menge zu produzieren. Für die Produktion von Impfstoffen müssen die Pflanzen aber noch weitere Eigenschaften aufweisen.
• oSie müssen essbar sein, d. h., dass Produzenten von giftigen Sekundärstoffen wie Tabak nur als Modellsysteme in Betracht kommen. Kartoffeln lassen sich, obwohl es nicht gerade üblich ist, auch roh verzehren und bieten so die Möglichkeit zum Test.
• oSie sollten ein schnelles Wachstum aufweisen, leicht kultivierbar sein und in der Regel roh verzehrt werden. Dies ist wichtig, damit die Proteine in der natürlichen Konfiguration vorliegen und nicht durch Kochen denaturiert werden.

Versuche mit Kartoffeln

Das für LT-B kodierende Gen von E. coli wurde mit transformiertem Agrobacterium tumefaciens in Kartoffeln eingeschleust (Abb. 3). Darauf exprimierten einzelne Pflanzen in den Kartoffelknollen 30 µg LT-B pro Gramm löslichen Proteins [9]. Eine weitere Steigerung der LT-B-Produktion konnte erreicht werden, indem das Gen mit einem zusätzlichen Sequenzabschnitt versehen wurde, der dafür sorgt, dass das gebildete Protein innerhalb der Pflanzenzelle in die Mikrosomen geleitet wird. Diese Pflanzen konnten bis zu 110 µg/g LT-B bilden. Generell ist es wichtig, den Metabolismus der Pflanze zu kennen, um eine optimale Expressionsrate zu erreichen.

Austausch bestimmter Codons

Eine andere Möglichkeit, die Menge des gebildeten Proteins zu erhöhen, besteht darin, das Gen an den Metabolismus des neuen Wirtes anzupassen. Obwohl der genetische Code universell ist, haben die unterschiedlichen Organismen bezüglich seiner Nutzung bestimmte Präferenzen entwickelt. Gene, die in Bakterien sehr effizient in Proteine übersetzt werden (wie z. B. LT-B in E. coli), können zwar auch von der Pflanze abgelesen werden, die Expression muss aber nicht zwangsläufig mit der gleichen Effektivität erfolgen. Denn manche Nucleotid-Tripletts, die für eine bestimmte Aminosäure codieren, finden in Pflanzen nicht oder nur in geringem Maße Verwendung und können somit nicht effektiv übersetzt werden. Eine Analyse des LT-B-Gens zeigte eine Reihe solcher nicht-favorisierter Codons, welche einen Einfluss auf die Menge des gebildeten Proteins haben könnten. Durch die Herstellung eines synthetischen Gens konnten alle diese Codons ausgetauscht werden, ohne dabei den Informationsgehalt des Gens zu verändern. Bakterielles sowie synthetisches Gen codieren also nach wie vor für dasselbe Protein. Das synthetische Gen wurde von den Kartoffelpflanzen allerdings wesentlich effektiver umgesetzt, was sich in einer Expressionsrate von bis zu 17 µg/g Frischgewicht Kartoffelknolle (entsprechend 0,2% des Gesamtproteingehalts) zeigte [10]. Erste Studien, die an Mäusen durchgeführt wurden, zeigten, dass nach viermaliger Gabe von 5 g Kartoffel (entsprechend 20 oder 50 µg LT-B) signifikante Mengen an Serum- und sezernierten Antikörpern gebildet wurden. Obwohl dadurch nur ein teilweiser Impfschutz aufgebaut werden konnte, zeigt dieses Beispiel doch, dass antigenproduzierende Pflanzen durchaus nutzbar sind. Kürzlich durchgeführte Studien am Menschen unterstreichen diese Aussage eindrücklich [11].

Viren-Hüllproteine als Antigene

Auch zahlreiche Viren werden durch kontaminiertes Trinkwasser übertragen und verursachen Durchfallerkrankungen, wie z. B. das Norwalk- oder das Rotavirus. Infektionen induzieren vor allem die Bildung gegen die Virushülle gerichteter Antikörper. Deshalb lassen sich Strukturen der Virushülle auch als Antigene zur Impfung einsetzen. Bestimmte Hüllproteine haben die Eigenschaft, sich selbstständig zu Viruspartikeln zusammenzulagern und somit ein Viruscapsid aufzubauen. Heterolog exprimierte Hüllproteine formen so Viruspartikel, die keine Erbinformation enthalten und demnach nicht virulent sind, aber trotzdem eine Immunantwort hervorrufen können (Abb. 4). Das für Hüllproteine codierende Gen des Norwalk-Virus wurde ebenfalls in Kartoffeln exprimiert, worauf sich in der Pflanze virusartige Partikel bildeten [12]. Um die Anzahl der virusartigen Partikel in der Pflanze zu erhöhen und ihre Stabilität zu verbessern, bedarf es allerdings noch weiterer Untersuchungen. Neben der verfügbaren Menge des Hüllproteins spielen vielleicht noch andere Faktoren eine Rolle beim Zusammenbau des Capsids. So könnten auch weitere Virusproteine beteiligt sein, wie es für das Humane Papillomavirus (HPV) gezeigt worden ist. Diese zusätzlichen Proteine müssten dann in der Pflanze co-exprimiert werden. Auch zeigen manche Viren einen wesentlich komplexeren Aufbau ihrer Hülle, wie z. B. das Rotavirus, dessen Capsid aus drei Schichten besteht und aus sechs Proteinen aufgebaut wird. Die parallele Expression von so vielen Proteinen und ihr Zusammenbau zu intakten Virushüllen stellen natürlich eine große Herausforderung dar. Das eingangs bereits erwähnte Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) übt seine immunisierende Wirkung ohne die zugehörige Virushülle aus. Auch in Pflanzen lassen sich HBsAg produzieren und für eine orale Immunisierung verwenden [13, 14]. Erste klinische Studien am Menschen sind vielversprechend, und vielleicht können in naher Zukunft Pflanzen eine sinnvolle Alternative zur herkömmlichen Hepatitis-B-Impfung bieten.

Produzent und Darreichungsform zugleich

Neben der Produktion viraler und bakterieller Antigene zur Herstellung von Impfstoffen könnten transgene Pflanzen noch weitaus mehr leisten. So können sie zur Produktion von Antikörpern für diagnostische und klinische Zwecke verwendet werden [15]. Auch tumorspezifische Antikörper-Fragmente konnten schon erfolgreich in Pflanzen produziert werden [16]. So groß die Zahl der Krankheiten ist, so groß ist auch die Zahl der Heilungs- und Präventionsmöglichkeiten. Transgene Pflanzen können natürlich nicht in jedem Fall eine sinnvolle Lösung bieten. Als Produzenten und gleichzeitige Darreichungsform neuer Heilmittel oder Impfstoffe gegen bestimmte Erkrankungen bieten sie allerdings ungeahnte Möglichkeiten [17, 18].

Auf dem Weg zur "Impfbanane"

Das Wissen über den Aufbau und die Ausbreitungswege der verschiedenen Erreger im Menschen sowie über die entsprechenden Abwehrmechanismen des Körpers ist die grundlegende Voraussetzung für die Entwicklung von Immuntherapeutika. Für die Produktion von essbaren Impfstoffen in Pflanzen muss außerdem die betreffende Pflanze insoweit erforscht sein, dass eine Expression des gewünschten Proteins in der erforderlichen Menge und Qualität auch erreicht werden kann. Nachdem erste Experimente mit Modellpflanzen wie Tabak oder Kartoffel gezeigt haben, dass die Entwicklung solcher "Impfpflanzen" prinzipiell möglich ist, können in Zukunft andere, geeignetere Pflanzen ausgewählt werden. Hierzu gehört vor allem die Bananenstaude, weil sie eine robuste, tropische Pflanze ist und ihre Früchte roh verzehrt werden (Abb. 6). Darüber hinaus hat sie einen hohen Proteingehalt und bietet so die Möglichkeit der Produktion großer Mengen an Fremdproteinen. Da inzwischen große Fortschritte in der Aufklärung der Genregulation in Bananen gemacht wurden [19] und auch eine stabile Transformation möglich ist [20], wird in Zukunft vielleicht eine transgene "Impfbanane" unseren Arzneischatz bereichern.

Kastentext: Optimierte Pflanzen

Pflanzen spielen seit jeher eine zentrale Rolle im Leben des Menschen: Als Produzenten von Nahrung, Kleidung, Baustoffen, aber auch als Quelle von Arzneistoffen. Ständig auf der Suche nach besseren Produkten und einem höheren Ertrag hat der Mensch die Kulturpflanzen durch langwierige Züchtung und Auslese optimiert und seinen Bedürfnissen angepasst. Erst die Fortschritte der Molekularbiologie der letzten Jahrzehnte machten allerdings den Austausch von Eigenschaften über die Artbarriere hinweg möglich und bieten für die Zukunft ungeahnte Möglichkeiten zur Schaffung von Pflanzen mit ganz neuen Eigenschaften.

Kastentext: Stabile Transformation durch Agrobakterien oder "Genkanone"

Agrobacterium tumefaciens wird häufig zur Erzeugung dauerhaft veränderter Pflanzen verwendet. Dazu wird das gewünschte Gen in das Plasmid des Bakteriums eingeführt. Das transformierte Bakterium infiziert dann die Pflanze und schleust das Plasmid in eine Zelle ein. Dort angekommen, wird die DNA stabil ins Pflanzengenom eingebaut und mit jeder Zellteilung weitergegeben. Die aus diesen Zellen regenerierten Pflanzen tragen in allen Zellen das Fremdgen, dessen Expressionsrate vom jeweils verwendeten Promotor bestimmt wird. Da der Einbau des Fremdgens ins Pflanzengenom hinsichtlich Ort und Anzahl der Integrations-Ereignisse rein zufällig erfolgt, erhält jede regenerierte Pflanze bezüglich der Expressionsrate individuelle Eigenschaften. Durch Screening ist es möglich, die transgene Pflanze mit der höchsten Expressionsrate zu finden und gezielt zu vermehren. Eine stabile Transformation kann ebenfalls durch Partikel-Beschuss erreicht werden. Hierbei werden mit DNA beladene Goldpartikel auf die Zellen geschossen. Einige Partikel durchschlagen die Zellwand, verbleiben in der Zelle, und die DNA wird ins Genom integriert. Diese transformierten Zellen können dann zur Regeneration intakter Pflanzen verwendet werden.

Kastentext: Vorübergehende Expression durch Pflanzenviren

Hierbei werden ausdifferenzierte Pflanzen mit einem transformierten, das Fremdgen enthaltenden Pflanzenvirus infiziert. Kurz nach der Infektion produzieren die Pflanzen für kurze Zeit große Mengen des gewünschten Proteins. Der Vorteil hierbei ist, dass die Pflanzen das Fremdprotein in großen Mengen nur über eine kurze Zeit produzieren. Allerdings ist es bisher nicht möglich, Multimere wie das HBsAg zu produzieren.

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